普瑞邦飼料中伏馬毒素HPLC檢測的解決方案
伏馬毒素起因和特性
伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌菌f.moniliforme和f.proliferatum在一定溫度和濕度條件下繁殖所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。直到1988年，南非和美國的研究人員才首次從霉變的玉米中分離出伏馬毒素（fumonisins）b1。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬菌素有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11種。糧食在加工、貯存、運輸過程中易受上述兩種真菌污染，特別是當(dāng)溫度適宜時，更利于其生長繁殖，從而產(chǎn)生出一類結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的毒素，其中FB1是其主要組分占60％以上，其毒性也最強。因此，伏馬毒素可以通過糧食加工、飼料生產(chǎn)等過程對畜牧業(yè)乃至人類健康產(chǎn)生較嚴(yán)重的危害。
伏馬毒素純品為白色針狀結(jié)晶，為一類相關(guān)的極性、水溶性代謝產(chǎn)物，為多氫醇和丙三羧酸的雙酯化合物，對熱很穩(wěn)定，不易被蒸煮破壞，在多數(shù)糧食加工處理過程均比較穩(wěn)定。
食品污染狀況
FB1對食品污染的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，主要污染玉米及玉米制品，其污染的飼料主要為以玉米為原料的飼料。FB1為水溶性霉菌毒素，對熱穩(wěn)定，不易被蒸煮破壞，所以同AFT（黃曲霉毒素）一樣，控制農(nóng)作物在生長、收獲和儲存過程中的霉菌污染仍然是至關(guān)重要。
伏馬菌素對玉米的污染率和污染水平受國家和地區(qū)、玉米品種、季節(jié)的影響。1995年～1996年，Amra等對從埃及不同省份收集的120份樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，冬季收集的白玉米和黃玉米FB1污染率均為最高。伏馬菌素還可以污染其他糧食及其制品，且不同地區(qū)污染狀況也存在差異。
1996年我國對玉米、小麥等糧食作物中FB1污染進(jìn)行調(diào)查。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)均有不同程度污染。我國食道癌高發(fā)區(qū)林縣的玉米伏馬菌素污染率為48%。因此，人們懷疑該地區(qū)食道癌高發(fā)與食用污染此毒素玉米相關(guān)。該毒素已被世界衛(wèi)生組織列為近年來首先進(jìn)行研究的幾種霉菌毒素之一。
伏馬毒素的危害
1．馬大腦白質(zhì)軟化癥
這是一種馬的神經(jīng)失調(diào)疾病。根據(jù)1988年南非研究人員的試驗結(jié)果，每天以0.125mg／kg體重的水平給馬進(jìn)行皮下注射，大約7天后馬開始發(fā)瘋、發(fā)狂，沖撞欄桿而死。解剖發(fā)現(xiàn)馬的大腦呈現(xiàn)白質(zhì)軟化癥狀。1989年，玉米中的伏馬毒素給美國有很多州的農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)造成了巨大的損失。
2．豬肺水腫
1992年和1994年美國和南非的科學(xué)家研究表明，每天伏馬毒素的攝取量在0.4mg／kg體重以上均可引發(fā)豬的肺水腫，還可造成豬生殖系統(tǒng)的紊亂，如早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎和發(fā)情周期異常等。這種病在美國及其他國家都有發(fā)現(xiàn)。
3．小鼠肝癌
1991年南非科研人員對小鼠進(jìn)行了伏馬毒素的毒理試驗，試驗結(jié)果表明伏馬毒素引發(fā)肝癌。1998年又對大鼠進(jìn)行了伏馬毒素毒理試驗，獲得相同的結(jié)果。
4．人類食道癌
早在1988年南非科學(xué)家就對食道癌發(fā)病率高和低的地區(qū)進(jìn)行過調(diào)查，食道癌發(fā)病率與主食玉米受伏馬毒素污染呈正相關(guān)，進(jìn)一步的動物試驗也得到了相同的結(jié)果。1994年中國學(xué)者和日本學(xué)者對食道癌高發(fā)區(qū)的河南省林縣進(jìn)行了一次調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)主食玉米中伏馬毒素水平高達(dá)30~50mg／kg，發(fā)霉玉米中伏馬毒素最高值達(dá)118.4mg／kg。目前伏馬毒素引發(fā)食道癌的機理還不清楚，需進(jìn)一步確證和研究。
2001年美國食品與藥物管理局(FDA)發(fā)布了供人類食用的玉米和玉米產(chǎn)品伏馬毒素最高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素最高限量為2mg／kg；同時，FDA的畜牧醫(yī)學(xué)中心(CVM)也發(fā)布了動物飼料中伏馬毒素的最高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定其限量范圍為1~50mg／kg。
表2 FDA對伏馬毒素在動物飼料中的推薦限量標(biāo)準(zhǔn)（2000年6月）
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玉米及其副產(chǎn)品用于下列動物飼料 |
推薦限量標(biāo)準(zhǔn)（FB1+FB2+FB3）,mg/kg |
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馬和兔 |
5ppm(不超過日食量的20%)* |
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豬和鯰魚 |
20ppm(不超過日食量的20%)* |
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產(chǎn)子的反芻動物、家禽、貂 |
30ppm(不超過日食量的20%)* |
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大于3月用于屠宰的反芻動物、用于制作裘皮的貂 |
60ppm(不超過日食量的20%)* |
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用于屠宰的家禽 |
100ppm(不超過日食量的20%)* |
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其他各種牲口和寵物 |
10ppm(不超過日食量的20%)* |
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*以干基作為計算基準(zhǔn) |
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伏馬毒素的檢測
伏馬毒素的檢測先后使用過薄層色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）等，目前研究和應(yīng)用得最多的是利用免疫親和柱凈化后的熒光儀檢測法和HPLC法。
普瑞邦伏馬毒素檢測方案介紹
（一） 免疫親和柱-高效液相色譜法：符合GBT 25228-2010 糧油檢驗 玉米及其制品中伏馬毒素含量測定 免疫親和柱凈化高效液相色譜法
Pribolab®（普瑞邦）應(yīng)用免疫親和柱凈化，利用高效液相色譜儀和熒光檢測器檢測可提供伏馬毒素測定的HPLC檢測方案，得出的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢出限好，是一種很好的檢測伏馬毒素的方法，僅供廣大用戶參考。
1. 設(shè)備和耗材配置
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序號 |
品名 |
規(guī)格及參數(shù) |
數(shù)量 |
用途 |
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1 |
高效液相色譜儀 |
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一臺 |
分析檢測 |
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2 |
熒光檢測器 |
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一臺 |
讀取熒光信號 |
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3 |
Pribolab真菌毒素專用色譜柱 |
150/250mm 貨號：PRC-18 |
一支 |
配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測用 |
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4 |
PriboFast®伏馬毒素免疫親和柱 |
3ml，25支/盒， 貨號：IAC-050-3 |
若干 |
高特異性，純化樣本 |
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5 |
高速均質(zhì)器 |
達(dá)到22000rpm 以上，貨號：EQ-WR-1L |
一臺 |
耐腐蝕，高速，均質(zhì) |
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6 |
PriboFast®玻璃纖維濾紙 |
100P,110mm，1.5μm 貨號：GMF-110 |
一盒 |
霉菌毒素專用過濾 |
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7 |
PriboFast®八位泵流操作架 |
貨號：EQ-PUMP-8 |
一臺 |
用于控制免疫親和柱過柱流速 |
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8 |
伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品 |
50µg/ml伏馬毒素B1, 50µg/ml伏馬毒素B2溶于乙腈/水（50/50）, 貨號：STD#2011 |
1ml |
用于定量分析標(biāo)準(zhǔn)品的配制 |
2. 樣品前處理:普瑞邦為飼料提供不同的處理方案(詳細(xì)方案請聯(lián)系普瑞邦，普瑞邦開發(fā)了針對多種飼料基質(zhì)提供優(yōu)化的處理方案)
樣品處理：
花生，玉米，大米，小麥及其制品和飼料
----將50 g 研磨的樣品 + 5g鹽置于均質(zhì)杯中。
----加入100mL 甲醇：水（80：20）溶液。
----蓋上杯蓋，高速均質(zhì)5分鐘。
----4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；
----取10mL濾液并加入40mL PBS溶液將濾液稀釋，混勻。用玻璃微纖維濾紙過濾，取稀釋后液體待測；
----將上步稀釋液通過微纖維濾紙過濾，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL。
3. 免疫親和柱凈化:
操作程序：符合GB/T 25228-2010國標(biāo)方法
----將免疫親和柱連接于泵流操作架的10mL注射器下。準(zhǔn)確移取10mL樣品提取液注入注射器；
----富集:將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使提取液以約2-3mL/min(1滴/3秒)流速緩慢通過免疫親和柱，直至2-3mL空氣通過柱體；
----洗滌: 用10mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2-3mL空氣通過柱體；
----洗脫可采取以下方式之一進(jìn)行: 優(yōu)選2
----洗脫1: 準(zhǔn)確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫,孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡),然后以流速為1-2mL/min過柱，收集全部洗脫液供檢測用。
----洗脫2: 為保證洗脫充分,建議以1.5mL色譜甲醇分兩步進(jìn)行洗脫，流速為1-2mL/min(1滴/秒,重力即可) 。首先，加入0.5ml甲醇洗脫，重力過柱，當(dāng)溶劑通過柱子后，等待30秒后再加入1ml甲醇進(jìn)行洗脫，過柱前孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡)。收集全部甲醇洗脫液供衍生化反應(yīng)用。
4. 衍生化反應(yīng)
分別取凈化后的樣本液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各50ul，分別置于1ml的各個試管中，各加入50ul OPA衍生液，渦流混合器上混合30s，靜置3min后，立即取20ul衍生液進(jìn)高效液相色譜儀分析。
5. 高效液相色譜分析
HPLC-色譜柱 ：C-18色譜柱 150 x 4.6 mm;
流 動 相 ：甲醇-0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液 77:23
流 速 ： 1 mL/min
柱 溫 ： 室溫
進(jìn) 樣 體 積 ： 20μL
熒光檢測器：λ-激發(fā)波長：335nm λ-發(fā)射波長：440 nm
HPLC配置：高效液相色譜儀帶有熒光檢測器
1. 谷物、飼料中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將谷物、飼料等貯存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。
2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員，必須注意防護(hù)，如穿戴隔離衣帽，在進(jìn)行真菌分離培養(yǎng)工作時，應(yīng)戴口罩，并盡量防止孢子飛揚。
3. 操作臺面如有漏濺，應(yīng)立即用新配的5％次氯酸鈉消毒。以5％次氯酸鈉（NaOCl）處理時，黃曲霉毒素于數(shù)秒鐘內(nèi)即被破壞，故是常用的消毒劑。
4. 也有應(yīng)用生物學(xué)方法解毒的報道，生物學(xué)方法成本低，收效大，可能是一種有前途的除毒措施。
鑒于霉菌毒素對人體的危害，提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護(hù)自身安全哦！
