GB/T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測定
食品中黃曲霉毒素的測定
—免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了免疫親和層析凈化—高效液相色譜法和免疫親和層析凈化—熒光光度法測定食品中黃曲霉毒素的條件和詳細(xì)分析步驟。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米、花生及其制品（花生醬、花生仁、花生米）、大米、小麥、植物油脂、醬油、食醋等食品中黃曲霉毒素的測定。
樣品中黃曲霉毒素的檢出限：免疫親和層析凈化—高效液相色譜法和免疫親和層析凈化—熒光光度法為1mg/kg；免疫親和層析凈化—熒光光度法測定醬油樣品中黃曲霉毒素檢出限為2.5mg/kg。
2 免疫親和層析凈化高效液相色譜法
2.1 方法提要
試樣經(jīng)過甲醇-水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫/PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量。
2.2 試劑和溶液
除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純
2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水
2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水
2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水
2.2.5 苯：色譜純
2.2.6乙腈：色譜純
2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯
2.2.8氯化鈉（NaCl）
2.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）
2.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）
GB/T 18979-2003
2.2.11氯化鉀（KCl）
2.2.12 PBS緩沖溶液：稱取8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。
2.2.13 吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20，加入PBS緩沖溶液并定容至1000mL。
2.2.14 pH7.0磷酸鹽緩沖溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氫鉀溶液與29.1mL 0.1mol/L的氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100 mL。
2.2.15 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2）：純度≥99%。
2.2.16 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：用苯-乙腈（98+2）溶液分別配制0.100mg/mL的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于4ºC備用。
2.2.17 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取適量的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用苯-乙腈（98+2）溶液稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
2.2.18 柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）：稱取0.1g碘，溶解于20mL甲醇后，加純水定容至200mL，以0.45μm的尼龍濾膜過濾，4℃避光保存。
2.3 儀器和設(shè)備
實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器、設(shè)備、材料及下列各項(xiàng)。
2.3.1 高速均質(zhì)器：18,000 r/min ~22,000 r/min。
2.3.2 黃曲霉毒素免疫親和柱。
2.3.3 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。
2.3.4 玻璃注射器：10 mL，20mL。
2.3.5 玻璃試管：直徑12 mm ，長75mm，無熒光特性。
2.3.6 高效液相色譜儀：具有360nm激發(fā)波長和大于420nm發(fā)射波長的熒光檢測器。
2.3.7 空氣壓力泵。
2.3.8 微量注射器：100mL。
2.3.9 色譜柱：C18柱（柱長150 mm ，內(nèi)徑4.6mm，填料直徑5mm）。
2.4 分析步驟
2.4.1提取
2.4.1.1大米、玉米、小麥、花生及其制品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過磨細(xì)（粒度小于2mm）的試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準(zhǔn)確加入125.0mL（ ）甲醇-水（7+3），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取15.0mL（ ）濾液并加入30.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.2 植物油脂：準(zhǔn)確稱取試樣25.0g于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及加入甲醇-水（7+3）至125.0mL（ ），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取15.0mL（ ）濾液并加入30.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.3 醬油：稱取試樣50.0g于250.0mL具塞錐形瓶中，加入2.5g氯化鈉及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL（ ），以均質(zhì)器高速攪拌提取1min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0mL（ ）濾液并加入40.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.4 食醋：準(zhǔn)確稱取5.0g樣品，加入1.0g氯化鈉，以pH7.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至25.0mL（ ），混勻，定量濾紙過濾。取10.0mL（ ）濾液加入10.0mL（ ）緩沖液，混勻。以玻璃纖維濾紙過濾1~2 次，至濾液澄清，備用。
2.4.2 凈化
2.4.2.1 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂： 將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取15.0mL（ ）樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.2.2 醬油： 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10mL（ ）醬油樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱。用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.2.3食醋： 將免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL（ ）食醋樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，用10mL 0.1%的吐溫/PBS溶液清洗，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2 mL~3mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。
2.4.3測定
2.4.3.1 高效液相色譜條件
流動(dòng)相：甲醇-水（45+55）
流速：0.8mL/min
柱后衍生化系統(tǒng)
衍生溶液：0.05%碘溶液
衍生溶液流速：0.2mL/min
反應(yīng)管溫度：70°C
反應(yīng)時(shí)間：1min
2.4.3.2 定量
用進(jìn)樣器吸取100mL黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液（2.2.17）注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值（峰高或峰面積），得到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖。參考譜圖見圖1。
圖1 黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2的標(biāo)準(zhǔn)譜圖
取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0mL，用進(jìn)樣器吸取100mL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的響應(yīng)值（峰高或峰面積）。經(jīng)過與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)液譜圖比較響應(yīng)值得到試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的濃度 。
2.4.4 空白試驗(yàn)
用水代替試樣，按2.4.1~2.4.3步驟做空白試驗(yàn)。
2.4.5 結(jié)果計(jì)算
檢測結(jié)果按公式（1）計(jì)算：
…………（1）
式中： — 試樣中黃曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）的含量，mg/kg；
— 試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；
— 空白試驗(yàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；
— 最終甲醇洗脫液體積，mL；
— 最終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量，g；
— 試樣稱取量，g；
— 樣品和提取液總體積，mL；
— 稀釋用樣品濾液體積，mL；
— 稀釋液體積，mL；
— 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。
黃曲霉毒素總量為B1、B2、G1、G2個(gè)別濃度之和，即B1+B2+G1+G2。
注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。
計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后2位。
3 免疫親和層析凈化熒光光度法
3.1 方法提要
試樣經(jīng)過甲醇-水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度。洗脫液通過熒光光度計(jì)測定黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）總量。
3.2 試劑和溶液
3.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純
3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水
3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水
3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水
3.2.5 苯：色譜純 不要去掉
3.2.6乙腈：色譜純
3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯
3.2.8氯化鈉（NaCl）
3.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）
3.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）
3.2.11氯化鉀（KCl）
3.2.12 溴溶液儲(chǔ)備液（0.01%）：稱取適量溴，溶于水，配成0.01%的儲(chǔ)備液，4℃避光保存。
3.2.13 溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混勻，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩Ｐ杳看问褂们芭渲啤?/DIV>
3.2.14 二水硫酸奎寧（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）
3.2.15 硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL濃硫酸，緩慢加入適量水中，冷卻后定容至1000mL。
3.2.16 熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液：稱取3.40g硫酸奎寧（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）用0.05 mol/L硫酸溶液稀釋至100mL，此溶液熒光光度計(jì)讀數(shù)相當(dāng)于20 mg/L黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.3 儀器和設(shè)備
3.3.1 熒光光度計(jì)
2.3.2 高速均質(zhì)器：18,000 r/min ~22,000 r/min。
2.3.3 黃曲霉毒素免疫親和柱。
2.3.4 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。
2.3.5 玻璃注射器：10 mL，20mL。
2.3.6 玻璃試管：直徑12 mm ，長75mm，無熒光特性。
2.3.7 空氣壓力泵。
3.4 分析步驟
3.4.1提取
同本標(biāo)準(zhǔn)2.4.1。
3.4.2 凈化
同本標(biāo)準(zhǔn)2.4.2。
3.4.3測定
3.4.3.1 熒光光度計(jì)校準(zhǔn)
在激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm條件下，以0.05mol/L硫酸溶液為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為0.0 mg/L；以熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液（3.2.16）調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為20.0 mg/L。
3.4.3.2 樣液測定
取上述凈化后的甲醇洗脫液加入1.0mL 0.002%溴溶液，混勻，靜置1min，按3.4.3.1條件進(jìn)行操作，于熒光光度計(jì)中讀取樣液中黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）的濃度 （mg/L）。
3.4.4空白試驗(yàn)
用水代替試樣，按3.4.1~3.4.3步驟做空白試驗(yàn)。
3.4.5結(jié)果計(jì)算
檢測結(jié)果按公式（2）計(jì)算：
…………（2）
式中： — 試樣中黃曲霉毒素（B1、B2、G1或G2）含量，mg/kg；
— 試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；
— 空白試驗(yàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；
— 最終甲醇洗脫液體積，mL；
— 最終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量，g；
— 試樣稱取量，g；
— 樣品和提取液總體積，mL；
— 稀釋用樣品濾液體積，mL；
— 稀釋液體積，mL；
— 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。
計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后1位。
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