1.技術(shù)背景

  米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產(chǎn)生的一種可以引起食物中毒的呼吸系統(tǒng)性毒素。其結(jié)構(gòu)如下圖所示，它是一種脂溶性酸性化合物，主要產(chǎn)生于谷類(lèi)發(fā)酵制品、變質(zhì)椰子食品及鮮銀耳類(lèi)產(chǎn)品中，有著比氰化物更強(qiáng)的生物毒性，攝入受其污染的食物會(huì)引發(fā)中毒，嚴(yán)重可致死亡。

目前市面上常用方法以及國(guó)標(biāo)規(guī)定方法為固相萃取柱凈化和液液萃取的凈化方法，可能會(huì)面臨操作復(fù)雜、有機(jī)試劑消耗大、干擾多、回收率低等問(wèn)題，Pribolab技術(shù)研發(fā)中心基于現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法的不足和局限性，建立了多功能凈化柱“一步法”凈化，可用于液相色譜二極管陣列檢測(cè)器或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)食品中的米酵菌酸殘留，具有前處理簡(jiǎn)單快速、環(huán)保低有機(jī)試劑消耗、回收率高，凈化效果好的特點(diǎn)，適用于各類(lèi)食品基質(zhì)中米酵菌酸的測(cè)定。

2.實(shí)驗(yàn)方法

參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中米酵菌酸的測(cè)定（GB 5009.189-2016），優(yōu)化前處理方法，使其適用于“一步法”快速高效凈化。

2.1實(shí)驗(yàn)試劑耗材

Pribolab® 500μg/mL米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（乙腈）

Pribolab®·ODS·C18 液相色譜柱

PriboFast® MFC 335多功能凈化柱

PriboFast玻璃纖維濾紙

乙腈水提取液：量取84 mL乙腈用水定容至100 mL，混勻備用。

2.2樣品制備與提取

干試樣經(jīng)粉碎過(guò)篩，濕試樣經(jīng)充分均質(zhì)，稱(chēng)取25.0g試樣置于錐形瓶中，加入100mL乙腈水提取液，混勻，超聲提取30min，5000 r/min離心5分鐘或用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，待凈化。

2.3試樣的凈化

取8mL上清液加入透明玻璃管中，使液體通過(guò)PriboFast® 335多功能凈化柱完成凈化。取凈化后的溶液過(guò)濾膜后上液相或液質(zhì)分析。

3.液相液質(zhì)條件

液相色譜條件	液相質(zhì)譜條件
色譜柱：Pribolab真菌毒素專(zhuān)用色譜柱C18(4.6*250 mm,5 μm)	Pribolab真菌毒素專(zhuān)用色譜柱C18（2.1*100 mm,1.8 μm）
流動(dòng)相：甲醇+水（1%乙酸）=80:20	0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脫
柱溫：30℃	30℃
進(jìn)樣量：20μL	1μL
流速：1ml/min	0.3μL/min
檢測(cè)器：267nm	ESI-MRM，負(fù)離子模式

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1實(shí)驗(yàn)譜圖

圖1 米酵菌酸液相色譜圖

          圖2米酵菌酸液質(zhì)TIC圖

4.2結(jié)果分析

米酵菌酸結(jié)構(gòu)式含有3個(gè)羧基（-COOH），酸性較強(qiáng)，容易丟失質(zhì)子而帶上負(fù)電荷，其保留因子和選擇性受pH值影響大，當(dāng)流動(dòng)相條件為酸性時(shí)可避免離子化從而得到對(duì)稱(chēng)色譜峰。因此液相色譜采用甲醇+1%乙酸水（80:20）為流動(dòng)相，分離效果好，方法檢出限為0.2μg/g。在液質(zhì)檢測(cè)中0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相，同樣酸性環(huán)境抑制了米酵菌酸的電離，使其以分子形式存在，在反向固定相中的保留增強(qiáng)，且減少了與固定相中殘存硅醇基的結(jié)合，有助于改善峰型，方法檢出限0.1μg/kg。

 本次實(shí)驗(yàn)選取了常被米酵菌酸污染的食品酸湯子、米粉、銀耳進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，加標(biāo)水平2 mg/kg,每種加標(biāo)做6個(gè)平行。結(jié)果如下表所示。

	米粉	銀耳	酸湯子
平均回收率(%)	88.77	92.46	83.41
相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）	3.8	2.4	3.1

 

5.結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立多功能凈化柱“一步法”凈化食品中的米酵菌酸，具有前處理簡(jiǎn)單高效，回收率高的特點(diǎn)，適用于液相以及液質(zhì)方法檢測(cè)米酵菌酸殘留，對(duì)食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定具有指導(dǎo)意義。