一、背景介紹

黃曲霉毒素M1 （Aflatoxin M1）屬于黃曲霉毒素一類結(jié)構(gòu)相似的化合物中的一種，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機率最高。物理化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，不被巴氏消毒法破壞。哺乳類動物攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料或食品后，通過羥基化作用轉(zhuǎn)化成黃曲霉毒素M1。黃曲霉毒素M1危害主要表現(xiàn)在致癌性和致突變性，對人及動物肝臟組織有破壞作用，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。

目前來講，Aflatoxin M1的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)，酶聯(lián)免疫檢測法等。液相色譜法可以精確的檢測奶制品中黃曲霉毒素的微小含量。而使用黃曲霉毒素M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中黃曲霉毒素M1殘留。

Pribolab(普瑞邦)作為專業(yè)從事霉菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)的主要供應(yīng)商之一，整合了原北京泰樂祺檢測應(yīng)用實驗室，更加專注于霉菌毒素檢測產(chǎn)品和技術(shù)解決方案的服務(wù),以期快速提出解決方案。針對幾年來牛奶及其制品中不斷出現(xiàn)的黃曲霉毒素M1超標(biāo)問題，建立了一套完整的解決方案。

二、參考標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)國標(biāo)《GB 5413.37—2010》食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品中黃曲霉毒素M1 的測定。

（一）免疫親和柱-高效液相色譜法：符合GB 5413.37-2010國標(biāo)方法

1. 所需設(shè)備和耗材　　

高效液相色譜儀

色譜柱：真菌毒素專用色譜柱（PRC-18，Pribolab）。

免疫親和柱：PriboFast®黃曲霉毒素M1免疫親和柱(IAC-012-3, Pribolab，25支/盒，快速過柱型，適用于粘稠樣本：如生鮮乳、酸奶等,有效解決過柱易堵問題)。

高速均質(zhì)器：不銹鋼耐腐蝕,轉(zhuǎn)速達(dá)到22000rpm 以上(EQ-WR-1L，Pribolab)。

玻璃纖維濾紙：PriboFast®玻璃纖維濾紙（GMF/A-110，Pribolab）

PriboFast®八位泵流操作架（Pribolab，用于控制免疫親和柱過柱流速）

標(biāo)準(zhǔn)品：Aflatoxin M1（固體標(biāo)準(zhǔn)品MSS1007  100ug或0.5µg/ml Aflatoxin M1 液體標(biāo)準(zhǔn)品，Pribolab)

2. 樣品前處理:普瑞邦針對生鮮乳、干酪、奶油等提供不同的處理方案(詳細(xì)方案請聯(lián)系Pribolab中國:400-688-5349，普瑞邦開發(fā)了針對多種奶品基質(zhì)提供優(yōu)化的前處理方案)

3. 免疫親和柱凈化: PriboFast®黃曲霉毒素M1免疫親和柱(IAC-012-3, Pribolab)

富集:提取液以2-3mL/min流速通過免疫親和柱，直至2-3mL空氣通過柱體；

洗滌: 10mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，以10mL水洗柱子2次，并使2-3mL空氣通過柱體。

洗脫：加入1.0mL色譜級甲醇洗脫,孵育30秒以上,以流速為1-2mL/min過柱，收集全部洗脫液供檢測用。

 

4. 高效液相色譜分析 

色譜柱：C18，長25 cm，內(nèi)徑4.6 mm；

流動相：25 %乙腈水溶液(10.2.1)；

流速：1 mL/min。

（二）酶聯(lián)免疫法

1. 方法原理

采用直接競爭酶聯(lián)免疫法，在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素M1抗原，加入樣本（或黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液）及辣根過氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素M1抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的抗原與預(yù)包被在板孔上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣品吸光值與其所含黃曲霉毒素M1量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中黃曲霉毒素M1的含量。

2. 試劑和材料：酶聯(lián)免疫試劑盒（PriboFastR黃曲霉毒素M1 試劑盒 EKT-012，Pribolab）

3. 樣本前處理：牛奶：離心取下層待測。奶粉：復(fù)溶離心取下層待測。

4. 檢測步驟

4.1 免疫反應(yīng)30min；洗板5次；顯色反應(yīng)30min；終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀OD值。

5. 分析結(jié)果的表述

用酶標(biāo)儀判讀結(jié)果。

（三）免疫金標(biāo)快速檢測法

1. 方法原理

黃曲霉毒素M1(AFM1)快速檢測條應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理，樣本中的黃曲霉毒素M1在酶標(biāo)孔中與膠體金標(biāo)記的特異性抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測線上AFM1－BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。如果樣本中黃曲霉素M1含量大于0.5 ug/L，檢測線不顯顏色，結(jié)果為陽性；反之，檢測線顯紅色，結(jié)果為陰性。

2. 試劑和材料

膠體金檢測試紙：PriboStripTM黃曲霉毒素M1免疫金標(biāo)快速檢測條（PR-012，Pribolab）

3. 分析步驟：奶粉復(fù)溶后檢測；液態(tài)奶直接檢測。吸取奶液滴加到加樣孔中，8-15分鐘讀取結(jié)果。在C線顯色的情況下：T 線顯色比C線深或一樣深是陰性。T 線顯色比C線淺，或無顯色是陽性結(jié)果。