競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定豬肉中的鹽酸克倫特羅
利用鹽酸克倫特羅試劑盒,對(duì)豬肉組織中殘留的鹽酸克倫特羅經(jīng)抽提、競(jìng)爭(zhēng)后,用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)分析。此法較適用于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn),檢測(cè)速度快、靈敏度高,是保證肉品衛(wèi)生安全的較好監(jiān)控方法
酶聯(lián)免疫吸附法是目前最佳的檢測(cè)方法。ELISA 檢測(cè)方法有雙抗體夾心法測(cè)抗原、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體等。該文是利用酶聯(lián)免疫吸附法中的競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,其原理是利用多克隆抗體既能與鹽酸克倫特羅結(jié)合,也能與包被抗原結(jié)合。這些包被抗原被固定在酶標(biāo)板孔壁上,當(dāng)樣品中含有瘦肉精時(shí),它與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體中有限量的結(jié)合位點(diǎn)。由于每一個(gè)孔中抗體的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相同,當(dāng)樣品中瘦肉精濃度低時(shí),就有更多抗體的位點(diǎn)與包被抗原結(jié)合,更多的抗體被固定在酶標(biāo)板壁上,就會(huì)與更多的酶標(biāo)二抗結(jié)合,所以結(jié)果就呈現(xiàn)深蘭色。相反,樣品的瘦肉精濃度高,結(jié)果就呈現(xiàn)淺蘭色。加入終止液后,蘭色相應(yīng)變成黃色,然后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)瘦肉精,具有速度快,靈敏度高的特點(diǎn),適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),對(duì)以后瘦肉精檢測(cè)工作的發(fā)展具有指導(dǎo)作用。
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1 原料的準(zhǔn)備
抽取具有一定批量的有代表性的無(wú)皮豬肉,剔除雜質(zhì)、脂肪。將精肉用剪切均質(zhì)勻漿機(jī) 混合均勻,放置冰箱冷凍備用。取搗碎的樣品5g ,加入25mL ,50mmolHCl 振動(dòng)1.5h ,以達(dá)到均質(zhì)。稱(chēng)取5g均質(zhì)物(相當(dāng)于1g 肝臟或肌肉),加入離心管中,10000r/min 離心15min。取上清液至另一個(gè)離心管中, 加1mol NaOH 300ul , 混合15min。加入4mL ,500mmol KH2PO4 (pH3.0),迅速混勻置于4攝氏度的冰箱內(nèi)保存至少1.5h。10000 r/min 離心15min ,分離上清液。
1.2 試劑 鹽酸克倫特羅—酶聯(lián)免疫試劑
1.3 MK3 FC酶標(biāo)儀、Wellwash 4mk2洗板機(jī)、 OMNI系列 多樣品prep ，高能混合Mixer, Macro ，手持TH剪切均質(zhì)勻漿機(jī) Finnpipette單道 8，12道微量加樣器 （由大陸代理商 平利洋公司友情提供咨詢熱線13581963618） 國(guó)產(chǎn)離心機(jī) 國(guó)產(chǎn)電熱恒溫水浴鍋。
1.4 方法
1.4.1 洗板 所有試劑回溫至室溫。將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10 倍。將酶聯(lián)免疫板取出,放在室溫下平衡5min。每孔加入300uL 洗液,放置1min ,再甩掉洗滌液,重復(fù)3 次,將板內(nèi)殘留洗滌液在吸水紙上甩干。
1.4.2 競(jìng)爭(zhēng) 試劑盒中的抗體按1∶1000 倍稀釋。加樣時(shí)在板上按1 到3 的順序加入標(biāo)樣,每孔100uL ,重復(fù)兩次,其它孔加入待測(cè)樣品,每孔100uL 抗體,注意加入抗體時(shí)不要讓槍頭沾染孔里的樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣,然后將酶標(biāo)板放入濕盒里,在37攝氏度下競(jìng)爭(zhēng)30min。
1.4.3 加二抗 試劑盒中的二抗標(biāo)記酶按1 :1000 稀釋。在酶聯(lián)板上每孔加200μL 配制好的二抗標(biāo)記酶,將其放入濕盒,置37攝氏度、30min。
1.4.4 加底物顯色 取底物A、底物B 按等體積混勻,在酶標(biāo)板上每孔加200μL 配好的底物顯色板顯色,顯色后每孔加入50uL 的終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)樣和各樣品450nm 處的光密度(OD)值,用瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)液200ng/mL 孔作為0孔。
2 討論
2.1 試劑盒的貯存 試劑盒在4攝氏度貯存。抗體和酶標(biāo)二抗(IGg-HRP)在常溫下容易變性,須冷凍保存,使用時(shí)直接拿出按比例稀釋。
2.2 加樣 實(shí)驗(yàn)中有3 次加樣步驟,即加標(biāo)本、酶結(jié)合物和底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物用微量加樣器加在ELISA板孔的底部,可用左手扶住微量加樣器的中部,避免加在孔壁上部,并防止濺出和產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器,使加液過(guò)程迅速完成。
2.3 保溫 在實(shí)驗(yàn)中有兩次抗原抗體反應(yīng),即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后�？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)或孵育。因?yàn)镋LISA 屬固相免疫測(cè)定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,加入板孔中的標(biāo)本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì),只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程,因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。溫育的溫度通常是37攝氏度,也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37攝氏度經(jīng)1～2h ,產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng),可提高反應(yīng)的溫度,但最高不要超過(guò)43攝氏度。保溫的方式采用水浴,將板置于不銹鋼電熱恒溫水浴鍋中,注意可將ELISA 板置于水浴箱中,ELISA 板底應(yīng)貼著水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),板一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。
2.4 洗滌 洗滌在ELISA 法過(guò)程中是很關(guān)鍵的一步。ELISA 就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。如果洗板被污染或洗滌用水被游離的酶標(biāo)記物污染、洗滌次數(shù)不夠或注水量不足、洗板后間隔時(shí)間太久致使板孔干燥等都會(huì)直接影響檢測(cè)的最終結(jié)果,嚴(yán)重者實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生顏色致使實(shí)驗(yàn)失敗。
2.5 顯色和比色 顯色是ELISA 中的最后一步溫育反應(yīng),此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無(wú)色,而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。酸性終止液H2SO4 會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色,此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)(450nm)測(cè)讀吸光值。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn),需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96 孔的座架中,才可進(jìn)行比色。并在加底物液顯色前將軟板邊緣剪凈,以使軟板
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