摘   要：2006年國(guó)家出臺(tái)的《嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)許可證審查細(xì)則》中明確要求采用國(guó)際通行的“熒光PCR儀”作為出廠檢驗(yàn)必備設(shè)備，此要求已成為乳品企業(yè)生產(chǎn)許可證核發(fā)的必要條件。本文簡(jiǎn)單綜述了國(guó)際通行的保證食品安全的食源菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、儀器和方法。介紹了乳制品高危致病菌——阪崎腸桿菌的危害、檢測(cè)必要性以及檢測(cè)方法的歷史演變。在介紹熒光PCR技術(shù)特征的同時(shí)，重點(diǎn)論述了熒光PCR方法檢測(cè)乳品中阪崎腸桿菌的政策要求、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、檢測(cè)步驟以及實(shí)驗(yàn)室建設(shè)要點(diǎn)。

本文以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)熒光PCR儀及試劑為例，具體介紹了阪崎腸桿菌檢測(cè)過(guò)程和篩選判別實(shí)例。

關(guān) 鍵 詞：食品安全、食源菌、乳品檢測(cè)、阪崎腸桿菌、熒光PCR儀、快速檢測(cè)

世界貿(mào)易的全球化同時(shí)也帶來(lái)了食品安全風(fēng)險(xiǎn)！食品安全是全球日益關(guān)注的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。全球每年發(fā)生食源性疾病數(shù)十億例，發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)生食源性疾病的概率也相當(dāng)高，平均每年1/3的人群感染食源性疾病。 近年來(lái)，世界范圍內(nèi)屢屢發(fā)生大規(guī)模食品安全事件，如：日本上萬(wàn)人葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致的雪印牛奶中毒、英國(guó)的瘋牛病、法國(guó)的李斯特氏病毒、泰國(guó)的禽流感、比利時(shí)的二惡英事件等。

每年由數(shù)十億例食源性疾病而導(dǎo)致的醫(yī)療費(fèi)增加、不安全食品的召回、以及產(chǎn)品的銷毀帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失不可估量！食品安全引起的“食物恐怖”：以食源菌或化學(xué)性、生物性、放射性等有害物質(zhì)污染甚至蓄意污染食品，導(dǎo)致人群傷害或死亡，破壞社會(huì)經(jīng)濟(jì)或政局穩(wěn)定的行動(dòng)或危險(xiǎn)越來(lái)越被人們所重視，如大頭娃娃和毒餃子事件，無(wú)一不給我們敲響警鐘。

其中食源菌污染是導(dǎo)致以上事件的主要原因，因此制定食源菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、采用國(guó)際通行的檢測(cè)儀器以及研制和使用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)際通行檢測(cè)儀器是被學(xué)界、政府、企業(yè)界和人民群眾公認(rèn)為目前的當(dāng)務(wù)之急。本文就乳制品中高危害致病菌——阪崎腸桿菌的檢測(cè)做一些簡(jiǎn)要的分析。

1.阪崎腸桿菌的危害及檢測(cè)的必要性

阪崎腸桿菌是奶粉(乳)制品中新發(fā)現(xiàn)的一種致病菌，可以引發(fā)嬰兒、早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結(jié)腸炎散發(fā)和暴發(fā)。研究報(bào)告表明嬰幼兒配方奶粉是主要感染渠道,由阪崎腸桿菌引發(fā)疾病而導(dǎo)致的死亡率可達(dá)40％～80%，已引起世界多國(guó)的重視。

阪崎腸桿菌已引起世界多國(guó)相關(guān)部門(mén)的重視。據(jù)報(bào)道,國(guó)外乳業(yè)巨頭曾因此被召回.在美國(guó)FDA2002年在本土某一些國(guó)際乳業(yè)巨頭生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉中檢出阪崎腸桿菌后，2003年又一家國(guó)際乳業(yè)巨頭公司主動(dòng)召回在美國(guó)生產(chǎn)的一批檢出極微量阪崎腸桿菌的罐裝早產(chǎn)兒特殊配方奶粉，阪崎腸桿菌從此成為世界矚目的焦點(diǎn)。但是幾年前國(guó)內(nèi)企業(yè)鮮有自查能力,原因是國(guó)內(nèi)以前還沒(méi)有專門(mén)的檢測(cè)手段,而去買(mǎi)一套以前國(guó)內(nèi)從未有過(guò)的檢測(cè)設(shè)備也不是馬上就可辦到的。目前,國(guó)外奶粉(乳)制品巨頭就以擁有先進(jìn)檢測(cè)手段作為一個(gè)有力的宣傳點(diǎn),比如惠氏（中國(guó)）宣稱保證在中國(guó)銷售的每一個(gè)產(chǎn)品都經(jīng)過(guò)了阪崎腸桿菌的檢測(cè)才上市；同樣宣稱擁有此檢測(cè)設(shè)備的企業(yè)還有美贊臣（中國(guó)）公司。

在國(guó)外發(fā)現(xiàn)的奶粉中的阪崎腸桿菌并非有其特定的區(qū)域局限性，中國(guó)奶粉企業(yè)又面臨一項(xiàng)大難題。值得慶幸的是：2005年5月20日，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院和天津出入境檢驗(yàn)檢疫局牽頭完成的《奶粉中阪崎腸桿菌檢測(cè)方法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)在京通過(guò)了審定。這項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)，解決了我國(guó)檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌無(wú)標(biāo)準(zhǔn)、無(wú)檢測(cè)方法的問(wèn)題。同年10月該標(biāo)準(zhǔn)被實(shí)施。與之配套2006年出臺(tái)了06版乳品企業(yè)生產(chǎn)許可證《關(guān)于印發(fā)食用植物油等26個(gè)食品生產(chǎn)許可證審查細(xì)則的通知》，其中《附件8：嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)許可證審查細(xì)則(2006版)》里明確規(guī)定采用國(guó)際通行的“熒光PCR儀”為出廠檢驗(yàn)必備設(shè)備。另外多部國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)明確要求用PCR方法檢測(cè)阪崎腸桿菌、食品中致病菌等。

如«中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)»SN/T 1632.1—2005奶粉中阪崎腸桿菌檢驗(yàn)方法 第1部分：分離與計(jì)數(shù)方法；第2部分：PCR方法；第3部分：熒光PCR方法；

SNT 1204-2003 植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法；

SNT 1635-2005 貝類中諾沃克病毒檢測(cè)方法 普通RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法等

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)正是采用國(guó)際通行的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行阪崎腸桿菌的檢測(cè)。除應(yīng)用于乳品企業(yè)外，還大量應(yīng)用于食品加工企業(yè)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)等。

為了打破國(guó)外先進(jìn)食源菌分子檢測(cè)儀器在我國(guó)的壟斷地位，同時(shí)降低食品加工企業(yè)擁有該類儀器的門(mén)檻，近年來(lái)我國(guó)政府十分重視扶持具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器的開(kāi)發(fā)和推廣工作。據(jù)《中國(guó)乳品工業(yè)》2007年總第198期，國(guó)產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀已通過(guò)性能檢測(cè)、，臨床試驗(yàn)，獲得了醫(yī)療器械注冊(cè)證。在多家乳品生產(chǎn)、食品加工、醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用，效果良好。性能達(dá)到國(guó)際同類產(chǎn)品先進(jìn)水平。

2.阪崎腸桿菌的檢測(cè)方法

常用病原菌檢測(cè)品種：沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森式菌、單增李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌等。包括阪崎腸桿菌。

檢測(cè)方法的歷史演變：通常檢測(cè)食物病原體有多種方法，如18世紀(jì)初，僅僅是通過(guò)常規(guī)尿液和血液成分檢測(cè)肝病、腎��；18世紀(jì)中，體液酶的分析通過(guò)堿性磷酸酶檢測(cè)肝功能； 血清淀粉酶檢測(cè)胰腺炎；酶類標(biāo)志物檢測(cè)心臟�。�19世紀(jì)，放射及酶聯(lián)免疫分析激素檢測(cè)內(nèi)分泌功能；腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)癌癥；蛋白標(biāo)志物檢測(cè)心臟病；到了20世紀(jì)，生化檢測(cè)血糖等——糖尿病、心血管；生理參數(shù)——心血管病等；21世紀(jì)，應(yīng)用分子生物學(xué)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分子診斷儀實(shí)現(xiàn)基因診斷：食品安全、病原體及傳染、腫瘤、遺傳病等

各種檢測(cè)方法從靈敏度、特異性、抗污染、易操作性四方面比較表明，PCR檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、抗污染能力強(qiáng)｛熒光PCR｝、容易操作等特點(diǎn)。

PCR檢測(cè)方法又分為三種：熒光法、電泳法、ELISA法。分析對(duì)比圖見(jiàn)下表：

3.熒光PCR方法簡(jiǎn)述

PCR歷史發(fā)展的三個(gè)階段：定性PCR（電泳法）、酶免法 定量PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比定性PCR技術(shù)發(fā)明晚將近十年，相比定性PCR，它有如下突出優(yōu)點(diǎn)：

熒光定量PCR 反應(yīng)過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、熒光定量重復(fù)性好、基因定量分析——穩(wěn)定性好、熒光檢測(cè)——濃度梯度試驗(yàn)線性范圍寬、熱循環(huán)升降溫快速、熒光定量在對(duì)數(shù)期進(jìn)行定量分析等優(yōu)勢(shì)。

西安天隆TL988熒光定量PCR儀曲線

4.熒光PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)要點(diǎn)

由于PCR技術(shù)特別靈敏，為防止試驗(yàn)過(guò)程交叉污染，應(yīng)根據(jù)《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)和《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號(hào)相關(guān)要求，對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行防污染布局和管理。PCR實(shí)驗(yàn)室原則上應(yīng)分為四個(gè)隔開(kāi)的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，分別是1 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、2 標(biāo)本制備區(qū)、3擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)管理辦法規(guī)定，如果使用實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀，各區(qū)域可適當(dāng)合并，我們建議將擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)合并為擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)即共三個(gè)間。

5.阪崎腸桿菌熒光PCR檢測(cè)步驟（以西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的TL988型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及阪崎腸桿菌檢測(cè)熒光試劑為例）

[標(biāo)本取樣]   取樣前消毒樣品包裝的開(kāi)啟處和取樣工具。按照“三管”增菌法，無(wú)菌稱取100g，10g和1g樣品各三份分別加入2L，250ml，125ml的樣品稀釋瓶中，加入9倍預(yù)熱到45℃的滅菌水[1：10稀釋]，或者將樣品直接稱量到裝有9倍預(yù)熱的45℃的滅菌水的樣品稀釋瓶中，振蕩使樣品充分混勻，36℃±1℃培養(yǎng)18～22h。

    分別移取培養(yǎng)18～22h的懸液各10ml加入90ml腸桿菌增菌肉湯[EE肉湯]中，36℃±1℃培養(yǎng)18～22h。

[檢測(cè)步驟]

試劑制備

取出反應(yīng)管N支（N＝樣本數(shù)＋1管陽(yáng)性對(duì)照＋1管陰性對(duì)照），瞬時(shí)離心后，存于4℃?zhèn)溆谩?/SPAN>

DNA提取

標(biāo)本處理：每瓶培養(yǎng)的EE肉湯分別取1ml加到1.5ml無(wú)菌離心管中，8000r/min離心5min，盡量吸棄上清液；加入50ulDNA提取液[使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸取]，混勻后沸水浴10min,12000r/min離心5min,取上清液2ul做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增

---加樣 取出備用的PCR反應(yīng)管，分別加入處理后的樣品上清2ul，陰陽(yáng)性對(duì)照直接加2ul，瞬時(shí)離心后放入儀器樣品槽進(jìn)行PCR反應(yīng)。 

---編輯  2．1點(diǎn)擊新建文件，輸入實(shí)驗(yàn)文件名稱  2．2對(duì)應(yīng)樣品槽樣本放置順序設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照以及未知標(biāo)本，并在Name攔中設(shè)置樣品名稱。 2．3 換到溫度設(shè)置窗口設(shè)置循環(huán)條件：如下

編輯完成后點(diǎn)擊開(kāi)始運(yùn)行，出現(xiàn)熱蓋溫度是否等待，請(qǐng)點(diǎn)擊是。

試驗(yàn)有效性判定  設(shè)定閾值線高于陰性對(duì)照最高點(diǎn)，陽(yáng)性對(duì)照的Ct值＜25，反應(yīng)有效。

結(jié)果判定 設(shè)定閾值線高于陰性對(duì)照最高點(diǎn)， 檢驗(yàn)樣本Ct值小于或等于25.0時(shí)，報(bào)告阪崎腸桿菌篩選陽(yáng)性；檢驗(yàn)樣本Ct值大于25.0且小于30.0時(shí)，重復(fù)一次，如果Ct值仍小于30.0，且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，可報(bào)告阪崎腸桿菌篩選陽(yáng)性，否則報(bào)告阪崎腸桿菌未檢出；樣本檢驗(yàn)不到Ct值時(shí)，或Ct值為0時(shí)，報(bào)告阪崎腸桿菌未檢出。