導(dǎo)讀 
PIK3CA基因編碼的p110α是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的催化亞基，在細胞的生長、增殖、凋亡和代謝等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。腫瘤基礎(chǔ)科研和臨床研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因的突變會導(dǎo)致PI3K信號通路異常激活，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，檢測PIK3CA基因的突變對于腫瘤的診斷、預(yù)后評估和治療具有重要意義。

PIK3CA突變通常為體細胞突變僅發(fā)生在腫瘤細胞中，并且一般是低頻突變，傳統(tǒng)的檢測方法，如qPCR、Sanger測序、NGS等，存在靈敏度不足、操作復(fù)雜和高成本等缺點。此外，現(xiàn)有檢測方法通常無法實現(xiàn)高通量、多位點的同時檢測，限制了其臨床應(yīng)用。

近日，荷蘭鹿特丹大學(xué)醫(yī)學(xué)中心在The Journal of Applied Laboratory Medicine上發(fā)表了題為"A Multiplex Assay for Fast PIK3CA Hotspot Mutation Characterization in a Singe Specimen by 3-Color Digital PCR Analysis" 的文章，該研究開發(fā)了一種高階多重數(shù)字PCR（dPCR）檢測方法，實現(xiàn)了單孔對單個樣本中4種PIK3CA熱點突變的經(jīng)濟快速精準檢測。

 研究亮點：
• 通過3色數(shù)字PCR平臺可以在單個反應(yīng)中同時檢測4種PIK3CA熱點突變。

• 變異等位基因頻率（VAF）的檢測下限低至0.003%，適用于液體活檢和腫瘤組織樣本。

• 與現(xiàn)有的單重dPCR檢測和NGS分析相比，該方法成本更低，且所需的cfDNA量更低。

 實驗結(jié)果：
作者設(shè)計一種多重dPCR檢測方法，用于同時評估PIK3CA基因中最常見的4種熱點突變：exon 9的p.E542K和p.E545K突變，以及exon 20的p.H1047L和p.H1047R突變。該方法還包括了一個exon 20區(qū)域的內(nèi)參探針，用于計算4種突變的變異等位基因頻率（VAFs）。

利用 Naica Prism軟件生成的散點圖，顯示了 PIK3CA 突變及參考基因的微滴分布。通過dPCR，可以在(圖A)二維圖中同時評估不同的突變，這些突變在特定的相對熒光強度（RFU）內(nèi)形成明顯的聚集(圖B)。在二維圖 C, D 中，參考基因可以通過綠-藍(C) 或綠-紅(D) 圖進行計數(shù)，所有RFU高于 22K的點。p.H1047R 和 p.E545K 突變的微滴位于藍色軸 (C) 的 25 到 30 K 和 35 到 40 K RFU 范圍內(nèi)，而 p.E542K 和 p.H1047L 突變的微滴分布在紅色軸 (D) 的 40 到 50 K 和 35 到 40 K RFU 范圍內(nèi)。

作者比較了商業(yè)單重檢測試劑盒和多重 dPCR 檢測方法，分析了具有理論 VAF 為 15% 的樣本（原始樣本，下圖A左）和預(yù)擴增后的樣本（預(yù)擴增樣本，下圖A右）。單重和多重檢測的結(jié)果分別用淺色和深色顯示。對于 p.E542K（P = 0.12, P = 0.23）、p.E545K（P = 0.13, P = 0.60） 和 p.H1047L（P = 0.38, P = 0.82）突變，單重與多重檢測方法在原始和預(yù)擴增樣本中分析的 VAF 無顯著差異。但在單重檢測中，預(yù)擴增樣本的 p.H1047R 測得的 VAF 低于預(yù)期（P = 0.03），而多重檢測方法在原始和預(yù)擴增樣本中都準確地檢測出預(yù)期的 VAF（P = 0.63）。

作者通過梯度稀釋探索了多重dPCR檢測方法對PIK3CA熱點突變的檢測限LOD（Limit of Detection）。下圖B顯示了在不同VAF稀釋度（15%，1%，0.5%，和0.25%）下，對于每種突變（p.E542K、p.E545K、p.H1047L和p.H1047R）檢測到的VAFs。多重檢測方法可以檢測到低至0.25% VAF的突變拷貝。

為了確定該方法的LOB (Limit of Blank)，作者通過20個來自健康志愿者的陰性對照cfDNA樣本來確定突變拷貝濃度（拷貝數(shù)/µL）、突變拷貝總數(shù)以及VAF的最小閾值。經(jīng)過評估，在原始和預(yù)擴增樣本中只有VAF大于等于0.003%和0.68%的樣本被視為真正陽性（見下表）。

作者使用經(jīng)NGS檢測PIK3CA突變陽性的96名乳腺癌患者的預(yù)擴增cfDNA樣本進行多重dPCR評估，并將結(jié)果與之前NGS的結(jié)果進行比較。在不使用和使用LOB的情況分別在96個（100%）和82個（85%）cfDNA中確認了突變。此外，預(yù)擴增cfDNA中通過dPCR檢測的VAF與NGS檢測的原始cfDNA中的VAFs高度相關(guān)（下圖A，Rp>0.79，P<0.001）。使用經(jīng)NGS檢測PIK3CA突變陰性的12名乳腺癌患者的預(yù)擴增cfDNA樣本進行了多重dPCR評估，設(shè)置LOB后可以將11名患者判定為陰性，在患者4原始樣本中檢測到了帶有p.H1047R突變的cfDNA（下圖B）。

(A)使用多重dPCR檢測對NGS檢測PIK3CA突變陽性的96名患者乳腺癌cfDNA中的4種突變進行了評估。圖中顯示了通過NGS和dPCR檢測的VAF，其結(jié)果具有良好的相關(guān)性。(B)使用多重dPCR檢測對NGS檢測PIK3CA為野生型的12名患者原始和預(yù)擴增cfDNA進行多重dPCR檢測評估。

 結(jié)論：

作者開發(fā)了一種基于三色數(shù)字PCR的多重檢測方法，能夠快速、準確地同時檢測 PIK3CA 基因的 4種常見熱點突變。通過與NGS結(jié)果的比較，驗證了該檢測方法在臨床樣本中的診斷準確性，展示了其在癌癥基因檢測領(lǐng)域的巨大潛力。相比傳統(tǒng)的單重檢測方法，多重數(shù)字PCR方法顯著降低了檢測成本，提升了檢測效率，保證了靈敏度和準確性。未來，該技術(shù)有望廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷、治療指導(dǎo)以及其他遺傳突變相關(guān)的研究和臨床應(yīng)用中，為個性化精準醫(yī)學(xué)發(fā)展提供強有力的技術(shù)支持。

參考文獻：

Helmijr, Jean, et al. "A Multiplex Assay for Fast PIK3CA Hotspot Mutation Characterization in a Single Specimen by 3-Color Digital PCR Analysis." Journal of Applied Laboratory Medicine, vol. 9, no. 5, Sept. 2024, pp. 913–925. https://doi.org/10.1093/jalm/jfae064.

實體瘤突變檢測可用于患者全病程管理（基因分型、靶向藥檢測、療效和預(yù)后評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測），艾普拜生物已開發(fā)測試針對多種樣本類型（體液、新鮮冰凍組織、FFPE）的常見突變數(shù)字PCR檢測試劑盒，詳情見下表。另有多款數(shù)字PCR試劑盒可用于血液腫瘤全病程管理和病原微生物檢測。歡迎咨詢和訂購。