導(dǎo)讀
在轉(zhuǎn)移性乳腺癌（MBC）患者的臨床管理中，精確評(píng)估腫瘤的分子特征至關(guān)重要，尤其是在預(yù)測治療反應(yīng)和監(jiān)測耐藥性方面。ERBB2（或HER2）基因的擴(kuò)增或突變?cè)谌橄侔┑陌l(fā)病機(jī)制中起著重要作用，約20%的乳腺癌患者具有ERBB2的過表達(dá)或擴(kuò)增。這類患者通常表現(xiàn)出較為侵襲性的疾病，并且對(duì)抗HER2的靶向治療（如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）具有良好的反應(yīng)。然而，隨著治療的進(jìn)行，部分患者可能會(huì)出現(xiàn)耐藥性，尤其是在疾病轉(zhuǎn)移階段，HER2的基因突變或擴(kuò)增狀態(tài)可能發(fā)生變化，導(dǎo)致療效下降。

傳統(tǒng)ERBB2的檢測方法主要包括免疫組化、熒光原位雜交和基因擴(kuò)增分析（如PCR）。這些方法通常基于腫瘤組織樣本，但在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，獲取可用于檢測的組織樣本往往較為困難，且侵入性較大。與此同時(shí)，腫瘤的異質(zhì)性也可能導(dǎo)致在不同病灶間ERBB2狀態(tài)的差異，從而影響檢測結(jié)果的可靠性。

法國雷恩尤金馬奎斯中心在Molecular Oncology發(fā)表了題為"Plasma-based analysis of ERBB2 mutational status by multiplex digital PCR in a large series of patients with metastatic breast cancer "的文章。該研究聚焦于利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿中的ERBB2基因突變狀態(tài)。作者探討了通過血漿中的cfDNA檢測ERBB2突變狀態(tài)，作為一種非侵入性且可靠的檢測方法的可能性。

 應(yīng)用亮點(diǎn)：
• 通過多重?cái)?shù)字PCR（mdPCR）技術(shù)分析血漿樣本中的ERBB2突變狀態(tài)，能夠高精度地檢測到低頻突變，在cfDNA檢測中且具有非常高的靈敏度和特異性。

• 通過大量患者樣本檢測，展示了該技術(shù)在不同臨床背景下廣泛適用性和穩(wěn)定性，提高了研究結(jié)果的可靠性。

 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、多重篩查檢測方案的設(shè)計(jì)和優(yōu)化
研究者設(shè)計(jì)開發(fā)了一個(gè)ERBB2 (S) assay，能夠單孔檢測17種不同的ERBB2突變，方案見下圖：

(A)ERBB2(S) assay的設(shè)計(jì),使用四對(duì)引物（灰色箭頭）同時(shí)擴(kuò)增四個(gè)片段。FAM標(biāo)記探針（藍(lán)色）檢測S310F和S310Y突變；HEX標(biāo)記探針（綠色）檢測D765S、D769H、D769Y、Y772_A775dup、G778_P780dup和L869R突變；FAM標(biāo)記的降落探針（藍(lán)色）+ Cy5標(biāo)記的參考探針（紅色）檢測776-779位點(diǎn)的突變。

(B) 三色檢測策略在772-780擴(kuò)增子上的不同擴(kuò)增情況。野生型序列：drop-off探針和參考探針都檢測到，產(chǎn)生FAM+Cy5雙陽性信號(hào)（case1）。776-779位點(diǎn)突變：僅檢測到參考探針，產(chǎn)生Cy5單陽性信號(hào)（case2）。772_A775dup或G778_P780dup突變: HEX探針和參考探針都檢測到，產(chǎn)生HEX+Cy5雙陽性信號(hào)（case3）。Y772_A775dup突變（case4）、G778_P780dup突變（case5）或兩者同時(shí)存在（case6）會(huì)產(chǎn)生FAM+HEX+Cy5+三陽性信號(hào)。

該方案中研究者通過不同的熒光信號(hào)組合來識(shí)別特定的ERBB2突變，為臨床提供精確的基因突變信息。這種多重檢測方法的優(yōu)勢在于能夠在同一反應(yīng)中檢測多種突變，提升檢測效率并降低成本。

2、ERBB2 (S) 檢測的優(yōu)化及驗(yàn)證

每個(gè)熒光通道陰陽性微滴的熒光閾值設(shè)置如下圖所示。設(shè)置閾值時(shí)，應(yīng)將陽性和陰性對(duì)照的點(diǎn)圖與樣本的點(diǎn)圖一起合并分析。確保在閾值設(shè)置后，陽性對(duì)照中的陽性微滴可以被正確統(tǒng)計(jì)。

使用系列稀釋的MUT gBlocks (設(shè)計(jì)合成特定的ERBB2基因突變位點(diǎn)，作為數(shù)字PCR檢測方法的陽性對(duì)照)在恒定的WT gDNA背景中進(jìn)行敏感性測試，結(jié)果表明檢測的敏感性分別為S310F/Y為0.25%，L755S-D769H/Y-L869R為0.27%，Y772_A775dup-G778_P780dup為0.18%，776-779MUT為0.10%。

(A)ERBB2(S)Assay：1D圖(左)：顯示了每個(gè)探針在單重反應(yīng)中產(chǎn)生的優(yōu)化熒光信號(hào)。2D圖(中)：展示了通過混合野生型gDNA和突變gBlocks定義的多邊形閾值策略。3D圖(右)：根據(jù)相對(duì)的FAM-HEX-Cy5熒光信號(hào)顯示簇的位置。
(B)六種野生型-突變雙重檢測定義的多邊形閾值的策略。

線性研究驗(yàn)證了在5到1000 copies/PCR動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的準(zhǔn)確性，線性回歸分析的R²值在0.9948到0.9999之間。

研究還評(píng)估了檢測的重復(fù)性和再現(xiàn)性，CV值在3.4%到12.5%之間，滿足數(shù)字PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中CV值小于20%的接受標(biāo)準(zhǔn)。

3、ERBB2突變的診斷策略
研究者開發(fā)了一個(gè)臨床兩步診斷策略（見下圖）：首先進(jìn)行初步的篩查，如果結(jié)果為陽性（即發(fā)現(xiàn)ERBB2基因的突變），則進(jìn)行第二步的WT-MUT Duplex檢測以精確識(shí)別突變類型。

4、患者樣本的ERBB2突變檢測結(jié)果
在272名HR+/HER2MBC患者的304份血漿樣本中，有9名患者（3.3%）至少攜帶一種ERBB2突變。突變樣本的cfDNA濃度和突變等位基因頻率（MAF）在不同患者中分布廣泛。

在9名突變患者中，有3名患者同時(shí)檢測到兩種ERBB2突變，這可能是由于檢測的高靈敏度，能夠檢測到低至0.06%的低頻突變。對(duì)其中兩名患者進(jìn)行了ERBB2突變水平的縱向隨訪，發(fā)現(xiàn)突變濃度的變化與疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)相關(guān)。

在6名患者的匹配腫瘤樣本中，有5名患者的ERBB2突變?cè)谘獫{cfDNA和腫瘤組織之間具有一致性。

結(jié)論：
多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)可以有效地檢測ERBB2突變狀態(tài)，并在晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。通過血漿樣本檢測ERBB2突變，不僅提供了對(duì)腫瘤基因組狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，而且能夠?yàn)閭�(gè)體化治療提供重要信息，為患者靶向治療的決策提供依據(jù)。數(shù)字PCR用于非侵入性檢測方法的開發(fā)平臺(tái)，有望成為未來乳腺癌分子診斷和監(jiān)測的重要工具。

參考文獻(xiàn)：
Corné J, Quillien V, Godey F, et al. Plasma-based analysis of ERBB2 mutational status by multiplex digital PCR in a large series of patients with metastatic breast cancer. Mol Oncol. 2024; ahead of print. doi:10.1002/1878-0261.13592.

實(shí)體瘤突變檢測可用于患者全病程管理（基因分型、靶向藥檢測、療效和預(yù)后評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測），艾普拜生物已開發(fā)測試針對(duì)多種樣本類型（體液、新鮮冰凍組織、FFPE）的常見突變數(shù)字PCR檢測試劑盒，詳情見下表。