導(dǎo)讀 
PIK3CA基因編碼的p110α是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的催化亞基，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。腫瘤基礎(chǔ)科研和臨床研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因的突變會(huì)導(dǎo)致PI3K信號(hào)通路異常激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，檢測(cè)PIK3CA基因的突變對(duì)于腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估和治療具有重要意義。

PIK3CA突變通常為體細(xì)胞突變僅發(fā)生在腫瘤細(xì)胞中，并且一般是低頻突變，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如qPCR、Sanger測(cè)序、NGS等，存在靈敏度不足、操作復(fù)雜和高成本等缺點(diǎn)。此外，現(xiàn)有檢測(cè)方法通常無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量、多位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)，限制了其臨床應(yīng)用。

近日，荷蘭鹿特丹大學(xué)醫(yī)學(xué)中心在The Journal of Applied Laboratory Medicine上發(fā)表了題為"A Multiplex Assay for Fast PIK3CA Hotspot Mutation Characterization in a Singe Specimen by 3-Color Digital PCR Analysis" 的文章，該研究開(kāi)發(fā)了一種高階多重?cái)?shù)字PCR（dPCR）檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了單孔對(duì)單個(gè)樣本中4種PIK3CA熱點(diǎn)突變的經(jīng)濟(jì)快速精準(zhǔn)檢測(cè)。

 研究亮點(diǎn)：
• 通過(guò)3色數(shù)字PCR平臺(tái)可以在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)4種PIK3CA熱點(diǎn)突變。

• 變異等位基因頻率（VAF）的檢測(cè)下限低至0.003%，適用于液體活檢和腫瘤組織樣本。

• 與現(xiàn)有的單重dPCR檢測(cè)和NGS分析相比，該方法成本更低，且所需的cfDNA量更低。

 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
作者設(shè)計(jì)一種多重dPCR檢測(cè)方法，用于同時(shí)評(píng)估PIK3CA基因中最常見(jiàn)的4種熱點(diǎn)突變：exon 9的p.E542K和p.E545K突變，以及exon 20的p.H1047L和p.H1047R突變。該方法還包括了一個(gè)exon 20區(qū)域的內(nèi)參探針，用于計(jì)算4種突變的變異等位基因頻率（VAFs）。

利用 Naica Prism軟件生成的散點(diǎn)圖，顯示了 PIK3CA 突變及參考基因的微滴分布。通過(guò)dPCR，可以在(圖A)二維圖中同時(shí)評(píng)估不同的突變，這些突變?cè)谔囟ǖ南鄬?duì)熒光強(qiáng)度（RFU）內(nèi)形成明顯的聚集(圖B)。在二維圖 C, D 中，參考基因可以通過(guò)綠-藍(lán)(C) 或綠-紅(D) 圖進(jìn)行計(jì)數(shù)，所有RFU高于 22K的點(diǎn)。p.H1047R 和 p.E545K 突變的微滴位于藍(lán)色軸 (C) 的 25 到 30 K 和 35 到 40 K RFU 范圍內(nèi)，而 p.E542K 和 p.H1047L 突變的微滴分布在紅色軸 (D) 的 40 到 50 K 和 35 到 40 K RFU 范圍內(nèi)。

作者比較了商業(yè)單重檢測(cè)試劑盒和多重 dPCR 檢測(cè)方法，分析了具有理論 VAF 為 15% 的樣本（原始樣本，下圖A左）和預(yù)擴(kuò)增后的樣本（預(yù)擴(kuò)增樣本，下圖A右）。單重和多重檢測(cè)的結(jié)果分別用淺色和深色顯示。對(duì)于 p.E542K（P = 0.12, P = 0.23）、p.E545K（P = 0.13, P = 0.60） 和 p.H1047L（P = 0.38, P = 0.82）突變，單重與多重檢測(cè)方法在原始和預(yù)擴(kuò)增樣本中分析的 VAF 無(wú)顯著差異。但在單重檢測(cè)中，預(yù)擴(kuò)增樣本的 p.H1047R 測(cè)得的 VAF 低于預(yù)期（P = 0.03），而多重檢測(cè)方法在原始和預(yù)擴(kuò)增樣本中都準(zhǔn)確地檢測(cè)出預(yù)期的 VAF（P = 0.63）。

作者通過(guò)梯度稀釋探索了多重dPCR檢測(cè)方法對(duì)PIK3CA熱點(diǎn)突變的檢測(cè)限LOD（Limit of Detection）。下圖B顯示了在不同VAF稀釋度（15%，1%，0.5%，和0.25%）下，對(duì)于每種突變（p.E542K、p.E545K、p.H1047L和p.H1047R）檢測(cè)到的VAFs。多重檢測(cè)方法可以檢測(cè)到低至0.25% VAF的突變拷貝。

為了確定該方法的LOB (Limit of Blank)，作者通過(guò)20個(gè)來(lái)自健康志愿者的陰性對(duì)照cfDNA樣本來(lái)確定突變拷貝濃度（拷貝數(shù)/µL）、突變拷貝總數(shù)以及VAF的最小閾值。經(jīng)過(guò)評(píng)估，在原始和預(yù)擴(kuò)增樣本中只有VAF大于等于0.003%和0.68%的樣本被視為真正陽(yáng)性（見(jiàn)下表）。

作者使用經(jīng)NGS檢測(cè)PIK3CA突變陽(yáng)性的96名乳腺癌患者的預(yù)擴(kuò)增cfDNA樣本進(jìn)行多重dPCR評(píng)估，并將結(jié)果與之前NGS的結(jié)果進(jìn)行比較。在不使用和使用LOB的情況分別在96個(gè)（100%）和82個(gè)（85%）cfDNA中確認(rèn)了突變。此外，預(yù)擴(kuò)增cfDNA中通過(guò)dPCR檢測(cè)的VAF與NGS檢測(cè)的原始cfDNA中的VAFs高度相關(guān)（下圖A，Rp>0.79，P<0.001）。使用經(jīng)NGS檢測(cè)PIK3CA突變陰性的12名乳腺癌患者的預(yù)擴(kuò)增cfDNA樣本進(jìn)行了多重dPCR評(píng)估，設(shè)置LOB后可以將11名患者判定為陰性，在患者4原始樣本中檢測(cè)到了帶有p.H1047R突變的cfDNA（下圖B）。

(A)使用多重dPCR檢測(cè)對(duì)NGS檢測(cè)PIK3CA突變陽(yáng)性的96名患者乳腺癌cfDNA中的4種突變進(jìn)行了評(píng)估。圖中顯示了通過(guò)NGS和dPCR檢測(cè)的VAF，其結(jié)果具有良好的相關(guān)性。(B)使用多重dPCR檢測(cè)對(duì)NGS檢測(cè)PIK3CA為野生型的12名患者原始和預(yù)擴(kuò)增cfDNA進(jìn)行多重dPCR檢測(cè)評(píng)估。

 結(jié)論：

作者開(kāi)發(fā)了一種基于三色數(shù)字PCR的多重檢測(cè)方法，能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè) PIK3CA 基因的 4種常見(jiàn)熱點(diǎn)突變。通過(guò)與NGS結(jié)果的比較，驗(yàn)證了該檢測(cè)方法在臨床樣本中的診斷準(zhǔn)確性，展示了其在癌癥基因檢測(cè)領(lǐng)域的巨大潛力。相比傳統(tǒng)的單重檢測(cè)方法，多重?cái)?shù)字PCR方法顯著降低了檢測(cè)成本，提升了檢測(cè)效率，保證了靈敏度和準(zhǔn)確性。未來(lái)，該技術(shù)有望廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷、治療指導(dǎo)以及其他遺傳突變相關(guān)的研究和臨床應(yīng)用中，為個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

Helmijr, Jean, et al. "A Multiplex Assay for Fast PIK3CA Hotspot Mutation Characterization in a Single Specimen by 3-Color Digital PCR Analysis." Journal of Applied Laboratory Medicine, vol. 9, no. 5, Sept. 2024, pp. 913–925. https://doi.org/10.1093/jalm/jfae064.

實(shí)體瘤突變檢測(cè)可用于患者全病程管理（基因分型、靶向藥檢測(cè)、療效和預(yù)后評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)），艾普拜生物已開(kāi)發(fā)測(cè)試針對(duì)多種樣本類(lèi)型（體液、新鮮冰凍組織、FFPE）的常見(jiàn)突變數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒，詳情見(jiàn)下表。另有多款數(shù)字PCR試劑盒可用于血液腫瘤全病程管理和病原微生物檢測(cè)。歡迎咨詢(xún)和訂購(gòu)。