前言

為了模擬腫瘤及其微環(huán)境的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)特征，三維腫瘤細(xì)胞球狀體模型已成為不可或缺的體外研究模型系統(tǒng)。本方案詳細(xì)闡述了利用 µ-Slide I Luer 3D 通道載玻片（87176，ibidi），在膠原蛋白 I 基質(zhì)中共培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞球狀體與內(nèi)皮細(xì)胞（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，即 HUVECs）的實(shí)驗(yàn)方法。此外，該模型支持通過(guò)灌流培養(yǎng)技術(shù)來(lái)模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件，為深入研究腫瘤血管生成機(jī)制及轉(zhuǎn)移過(guò)程提供了有力工具。

圖 1：灌流共培養(yǎng)示意圖。
 

1.實(shí)驗(yàn)材料：

請(qǐng)注意！本實(shí)驗(yàn)方案針對(duì) MCF 腫瘤細(xì)胞球狀體以及 HUVEC 細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化；當(dāng)使用其他細(xì)胞球狀體或內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)對(duì)試劑和緩沖液進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

1.1試劑與緩沖液：

• 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC，12203，Promocell）

• MCF-7 腫瘤細(xì)胞球狀體（CLS訂單號(hào)：Cryovial 300273，330273）

• 皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（ECGM，Promocell，C-22010）

• 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基 2（ECGM 2，Promocell，C-22011）

• 磷酸鹽緩沖液（14190144，Gibco）

• Accutase 細(xì)胞解離液（A1110501，Gibco）

• 大鼠尾源膠原蛋白 I，非胃蛋白酶處理，母液濃度 5 mg/mL（ibidi，50201），用 17.5 mM 乙酸溶液稀釋至 4 mg/mL；

• 10× RPMI 1640 培養(yǎng)基（Sigma，R1145）

• 1× RPMI 1640 培養(yǎng)基（Sigma，R8758）

• 培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（如L-谷氨酰胺，根據(jù)細(xì)胞類型而定）

• 1 M 氫氧化鈉溶液（溶于超純水）

• 7.5% 碳酸氫鈉溶液（Sigma，S8761）

• 無(wú)菌超純水

1.2設(shè)備與耗材：

• µ-Slide I Luer 3D 通道載玻片，經(jīng) ibiTreat 表面處理（87176，ibidi）

• ibidi 流體剪切力系統(tǒng)（10902，ibidi），含灰色灌流管套裝（10968，ibidi）

• 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（超凈工作臺(tái)、細(xì)胞解離試劑盒、培養(yǎng)瓶、移液器、吸頭、培養(yǎng)皿等）

• 倒置顯微鏡

• 冰塊與冷卻架

 

請(qǐng)注意！為避免氣泡產(chǎn)生，灌流管套裝與培養(yǎng)基的脫氣處理至關(guān)重要。請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前一天將灌流管套裝（不開(kāi)封）以及細(xì)胞培養(yǎng)基（置于一小瓶中，并略微擰松瓶蓋）置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行脫氣

—只要包裝未開(kāi)啟，上述用品即可保持無(wú)菌狀態(tài)。由于氣體在水和塑料材料中的溶解度會(huì)隨著溫度的變化而有所差異，因此這一步驟顯得尤為重要。具體而言，在高溫條件下，水和塑料 對(duì)氣體的吸收能力會(huì)減弱，相較于低溫條件下其吸收量會(huì)有所減少。

實(shí)驗(yàn)步驟：

實(shí)驗(yàn)者須在無(wú)菌條件下執(zhí)行以下步驟。

圖 2：實(shí)驗(yàn)流程示意圖。
 

2.制備 3D 基質(zhì)膠（載有細(xì)胞球狀體）

此共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的后續(xù)步驟需要先前生成的細(xì)胞球狀體——如需了解生成細(xì)胞球狀體的詳細(xì)步驟，請(qǐng)參閱以 下應(yīng)用指南：

請(qǐng)點(diǎn)擊：細(xì)胞球狀體形成簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案

• 根據(jù)通道載玻片說(shuō)明書(shū)中提供的相關(guān)指引，取出先前生成的球狀體，并在室溫層流罩下將細(xì)胞球狀體收集到一個(gè)試管中。

• 若需在基質(zhì)膠中添加補(bǔ)充劑，則需將補(bǔ)充劑加入 1×細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將其置于層流罩內(nèi)的冰塊上。

• 將所有余下成分以及一個(gè)足夠容納全部基質(zhì)膠的無(wú)菌試管一同置于層流罩內(nèi)的冰上。

• 按照本文表 1 中列出的順序，將除膠原蛋白和細(xì)胞懸液以外的所有成分用移液器移入試管中（試管始終置于冰塊上），輕柔吹打混勻，然后重新放回至冰上。

移液凝膠時(shí)的注意事項(xiàng)：

α）務(wù)必使用預(yù)冷到 4 ℃ 的移液器吸頭對(duì)凝膠進(jìn)行移液！

β）在制備層粘連蛋白-膠原蛋白 I 凝膠時(shí)，鑒于其高粘度特性，建議對(duì)包含層粘連蛋白與膠原蛋白 I 的所有操作步驟實(shí)施反向移液。其具體操作為：先將移液器按壓至預(yù)設(shè)的第二壓力點(diǎn)，使凝膠完全填充移液器吸頭；待分配凝膠時(shí)，僅達(dá)到第一壓力點(diǎn)即行釋放，此舉可確保移液管吸頭內(nèi)殘留的凝膠被排除，同時(shí)確保分配體積的精確度。另外，為優(yōu)化操作，可選用專為高粘度溶液設(shè)計(jì)的移液器，如 Eppendorf Visco 系列吸頭或 Gilson Microman E 型移液器，以提高工作效率。

γ）請(qǐng)?zhí)貏e注意，即便在 4°C 條件下，凝膠混合物在發(fā)生初步凝膠化前的可操作時(shí)間也僅限于大約 5 min，因此需嚴(yán)格控制操作時(shí)間以保證實(shí)驗(yàn)效果。

• 查閱產(chǎn)品分析證書(shū) (CoA)，了解特定批次產(chǎn)品的膠原蛋白濃度，隨后用 0.1 M 乙酸將大鼠尾源膠原蛋白 I 稀釋至 4.0 mg/mL，稀釋時(shí)需用移液器吹打混勻，其它詳情請(qǐng)參閱以下應(yīng)用指南：

請(qǐng)注意！在稀釋膠原蛋白 I 之前，實(shí)驗(yàn)者須將其反復(fù)吹打混勻，以形成均一溶液。

• 將膠原蛋白 I 加入至步驟 1- 中所制備的混合液中，在始終保持試管置于冰上的同時(shí)，將混合物上下吹打混勻；

• 將 MCF 腫瘤細(xì)胞球狀體懸液加入至上述混合液中（實(shí)驗(yàn)者應(yīng)在 50 μL 移液體積中移取盡可能多的細(xì)胞球狀體），隨后短暫渦旋以混合樣品；

• 至此，混合液已制備完畢，實(shí)驗(yàn)者可將其移入 µ-Slide I Luer 3D 通道載玻片中；在移液過(guò)程中，載玻片須始終置于冰上；

• 請(qǐng)注意！為避免載玻片底部被冰塊劃傷，請(qǐng)先將載玻片置于一培養(yǎng)皿中，再將該培養(yǎng)皿置于冰上。

• 撕去附于載玻片上表面的保護(hù)箔，并在每個(gè)孔中加入16 µL 含有細(xì)胞球狀體的膠原蛋白 I 基質(zhì)膠，操作時(shí)須避免產(chǎn)生氣泡；

• 將蓋玻片置于載玻片的粘性區(qū)域上，按壓蓋玻片以確保粘性區(qū)域妥善密封；

• 用隨附的蓋子覆蓋 Luer 接頭以保持其無(wú)菌狀態(tài)，并將載有基質(zhì)膠的載玻片置于 37°C、5% CO2CO_2 培養(yǎng)箱中凝膠化 45 min；

• 凝膠化完畢后，用相差顯微鏡 10× 物鏡鏡檢膠原蛋白纖維。

表 1：使用大鼠尾源膠原蛋白 I 與 RPMI 1640 培養(yǎng)基制備基質(zhì)膠的加樣方案，所有成分均按加樣順序列
 

3.接種內(nèi)皮細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)者須在無(wú)菌條件下執(zhí)行以下步驟。

• 如本文「設(shè)備與耗材」一節(jié)所述，若需使用 ibidi 流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行灌流培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)者需提前一天將灌流管套裝和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（ECGM 以及 ECGM 2 培養(yǎng)基）放入 37°C 培養(yǎng)箱中預(yù)熱；

• 使用 Accutase 細(xì)胞解離液解離 HUVEC 細(xì)胞 1~2 min；

• 收集細(xì)胞懸液，1000 rpm 離心 4 min，隨后用少量 ECGM 培養(yǎng)基重懸，以便計(jì)數(shù)；

• 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用適量 ECGM  培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×106cells/mL

• 用生物相容性 1 mL 注射器將約 250 μL 上述細(xì)胞懸液加入至載玻片通道中；

• 用標(biāo)準(zhǔn)吸頭從 Luer 接頭處吸去剩余細(xì)胞懸液，用隨附的蓋子覆蓋 Luer 接頭以保持其無(wú)菌狀態(tài)；

• 將載玻片連同一片無(wú)菌濕紙巾置于一培養(yǎng)皿中，隨后將該培養(yǎng)皿置于 37°C、5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育 2 h。

4. 連接到ibidi 流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞流體培養(yǎng)：

請(qǐng)注意！內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基 2 含有如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF） 等生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移和萌芽生長(zhǎng)。

• 孵育 2 h 完畢后，將載玻片與 ibidi 流體剪切力系統(tǒng)相連接，開(kāi)始進(jìn)行灌流培養(yǎng)；在灌流培養(yǎng)期間， 請(qǐng)按照使用說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備 ibidi 流體剪切力系統(tǒng)，并在儲(chǔ)液器中適量 ECGM2 培養(yǎng)基：

• 若需進(jìn)行延時(shí)序列成像，請(qǐng)將載玻片放入顯微鏡載物臺(tái)上的培養(yǎng)腔室（如 ibidi 載物臺(tái)培養(yǎng)箱）中， 并開(kāi)始延成像（如圖 3 所示）；若需進(jìn)行單幀成像，請(qǐng)?zhí)崆霸O(shè)置顯微鏡參數(shù)，以盡可能縮短成像時(shí)間。不成像時(shí)，請(qǐng)將載玻片放回培養(yǎng)箱；若需進(jìn)行終點(diǎn)分析，請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)固定細(xì)胞，然后繼續(xù)染 色（詳見(jiàn)本文「染色」一節(jié)）或執(zhí)行下游方案。

圖 3：灌流培養(yǎng)條件下的延時(shí)成像實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。
 

5.活細(xì)胞相差成像示例

圖 4：基質(zhì)膠上生長(zhǎng)的細(xì)胞球狀體（A）對(duì)焦的相差鏡檢圖像與接種 2 h 后的 HUVEC 細(xì)胞（B）對(duì)焦的相差鏡檢圖像；C）在灌流培養(yǎng)條件下（流速約為 0.5 mL/min）共培養(yǎng) 3 d 后的細(xì)胞球狀體與 HUVEC 細(xì)胞。

6.染色：

6.1.材料

• 磷酸鹽緩沖液（14190144，Gibco）

• 即用型 10% 福爾馬林溶液（HT5011，Sigma Aldrich）

• Alexa Fluor 488 標(biāo)記的抗 CD31 抗體（MA5-18135，Invitrogen）

• 鬼筆環(huán)肽-iFluor 647 染液（ab176758，Abcam）

• DAPI（D9542，Sigma Aldrich）

• Triton X-100 透化劑（A16046，Thermo Fisher Scientific）

• 破膜緩沖液（0.5% Triton X-100 透化劑，以磷酸鹽緩沖液稀釋）

• 封閉緩沖液（1% 牛血清白蛋白 + 0.2% Triton X-100 透化劑，以磷酸鹽緩沖液稀釋）

• 抗體稀釋緩沖液（1% 牛血清白蛋白 + 0.05% Triton X-100 透化劑，以磷酸鹽緩沖液稀釋）

• 牛血清白蛋白（A1470-10G，Sigma Aldrich）

6.2.染色步驟

• 為實(shí)驗(yàn)制備足量破膜緩沖液與封閉緩沖液；

• 斷開(kāi)載玻片與流體泵之間的連接；

• 用移液器由 Luer 接頭處吸出細(xì)胞培養(yǎng)基；

• 用 200 µL 磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌細(xì)胞 2 次，具體方法為：在一側(cè) Luer 接頭中加入磷酸鹽緩沖液， 直至觀察到液體由另一側(cè) Luer 接頭處溢出；

• 用 10%福爾馬林替換磷酸鹽緩沖液以固定細(xì)胞：首先在 Luer接頭處吸去磷酸鹽緩沖液，隨后在Luer接頭中加入 200µL10%福爾馬林并令其流過(guò)載玻片通道，然后在 Luer接頭處吸去此 200μL10%福爾馬林，再在 Luer接頭中加入另外 200µL10%福爾馬林，并孵育細(xì)胞 15min；【 】

• 吸去福爾馬林，并用 100 µL 磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞 4 次；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 破膜緩沖液替換磷酸鹽緩沖液，并孵育細(xì)胞 10 min； 吸去破膜緩沖液，用 200 μL 磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞 2 次；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 封閉緩沖液替換磷酸鹽緩沖液，并孵育細(xì)胞 30 min； 在封閉期間，制備足量抗體稀釋緩沖液以稀釋一抗和二抗；

• 用抗體稀釋緩沖液中將標(biāo)記的抗體（或一抗）以 1:100 體積比稀釋；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 一抗溶液替換封閉緩沖液，并 4°C 孵育細(xì)胞過(guò)夜；請(qǐng)注意！在以下步驟中，實(shí)驗(yàn)者須盡可能地將樣品置于暗處，以避免光漂白效應(yīng)。

• 用 200 µL 封閉緩沖液洗滌細(xì)胞 3 次；

• 在相同的抗體稀釋緩沖液中，將鬼筆環(huán)肽-iFluor 647 染液以 1：1000 體積比稀釋，將 DAPI 稀釋至

• 10 µg/mL；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 二抗染液替換封閉緩沖液，并避光孵育 2 h； 用 200 µL 封閉緩沖液洗滌細(xì)胞 3 次；

• 按照與步驟 類似的方法，每通道用 200 μL 磷酸鹽緩沖液替換封閉緩沖液；

• 將載玻片在4°C下避光保存直至鏡檢——理想情況下，應(yīng)立即進(jìn)行成像，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間保存可能會(huì)降低 圖像質(zhì)量。

• 

圖 5：在灌流共培養(yǎng) 3 d 后，對(duì)細(xì)胞球狀體和 HUVEC 細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞核：DAPI（藍(lán)色），肌動(dòng)蛋白絲：鬼筆環(huán)肽-iFluor 647（紅色），CD31（HUVEC特異性標(biāo)記）：Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體（綠色）

 

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