杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）是一種罕見的X連鎖隱性疾病，與嚴(yán)重的進(jìn)行性肌肉退化有關(guān)，最終因心肺衰竭而死亡。有研究在DMD小鼠模型的心肌細(xì)胞中觀察到了增殖非依賴性端�？s短。Alex C.Y. Chang等使用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs），結(jié)合HCells高通量單細(xì)胞功能檢測(cè)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)DMD hiPSC-CMs在纖維化樣生物工程水凝膠上顯示出力產(chǎn)生缺陷、鈣處理異常以及活性氧水平增加。此外還觀察到DMD hiPSC-CMs有絲分裂后端粒的逐漸縮短與shelterin復(fù)合物、端粒帽蛋白的下調(diào)和p53 DNA損傷應(yīng)答的激活同時(shí)發(fā)生。這種端�？s短可被抑制DMD心肌細(xì)胞收縮的（布雷他�。゜lebbistatin阻斷。研究強(qiáng)調(diào)了纖維化硬化在DMD心肌病病因中的作用，得到數(shù)據(jù)表明端�？s短是漸進(jìn)的、收縮依賴的，并且機(jī)械力敏感，為治療干預(yù)提供了見解。文章以“Increased tissue stiffness triggers contractile dysfunction and telomere shorteningin dystrophic cardiomyocytes”為題發(fā)表于Stem Cell Reports。

背景

       杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）是由編碼dystrophin（一種連接細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白）的基因中，> 200個(gè)突變引起的，發(fā)病率為1:5,000，DMD患者表現(xiàn)出早期和進(jìn)行性骨骼肌退化和無(wú)力，通常在30歲之前死于擴(kuò)張型心肌病和呼吸衰竭。DMD在心臟中的表現(xiàn)為心電圖異常、收縮和舒張功能障礙、纖維化，最終導(dǎo)致心力衰竭。AAV介導(dǎo)的基因治療和基因編輯策略在動(dòng)物模型中顯示出巨大前景。但因?yàn)槿狈��?duì)心力衰竭機(jī)制的理解，DMD患者接受的還是非特異性心力衰竭治療，如β受體阻滯劑或ACE抑制劑。

       以前發(fā)現(xiàn)dystrophin缺乏與較短的端粒有關(guān)，端粒是六核苷酸TTAGGG重復(fù)序列，覆蓋并保護(hù)染色體末端。通過(guò)用mdx4cv和TERC敲除（mTR）小鼠繁育出的mdx4cv/mTRG2小鼠可如實(shí)再現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病表型。定量熒光原位雜交（Q-FISH）測(cè)得mdx4cv/mTRG2小鼠和DMD患者心臟組織中，心肌細(xì)胞的端粒與mdx4cv/mTRHet小鼠對(duì)照或同齡人對(duì)照的端粒相比，信號(hào)減少了約50%。但這種與增殖無(wú)關(guān)的端�？s短的觸發(fā)機(jī)制仍然未知。

       為深入了解端�？s短的分子和細(xì)胞病因，研究人員使用由患者分化來(lái)的心肌細(xì)胞和同基因?qū)φ杖祟愓T導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC-CMs），構(gòu)建了培養(yǎng)條件下的人DMD心肌病模型，并繪制疾病進(jìn)展圖，這是一種用于研究心臟缺陷的強(qiáng)大系統(tǒng)。重要的是，建立了一個(gè)生物工程平臺(tái)，允許心肌細(xì)胞以1:7的縱橫比定向生長(zhǎng)并模擬DMD纖維化心臟的硬度。發(fā)現(xiàn)DMD hiPSC-CMs表現(xiàn)出異常的鈣處理、收縮缺陷和與增殖無(wú)關(guān)的端粒縮短。這種端�？s短發(fā)生于有絲分裂后，是進(jìn)行性的，且受收縮影響。通過(guò)在模擬健康和纖維化心肌硬度的生物工程平臺(tái)上培養(yǎng)hiPSC-CMs，發(fā)現(xiàn)DMD心臟的心肌硬度特征會(huì)加劇收縮功能障礙。

結(jié)果

01-杜氏hiPSC-CMs可再現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病的致病特征

       為研究DMD hiPSC-CMs端粒縮短的分子基礎(chǔ)，將6個(gè)DMD和6個(gè)對(duì)照hiPSC-CMs細(xì)胞系分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。使用了來(lái)自四個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室的來(lái)源于不同細(xì)胞類型的hiPSC細(xì)胞系，包括兩個(gè)通過(guò)CRISPR-Cas9（Con1和2對(duì)應(yīng)DMD1和2）糾正dystrophin突變的同基因?qū)�，一個(gè)通過(guò)CRISPR-Cas9（Con3對(duì)應(yīng)DMD3）將前六個(gè)外顯子的缺失引入健康細(xì)胞的同基因?qū)Γ�三個(gè)非家族健康對(duì)照（Con 4，5和6），和三個(gè)DMD細(xì)胞系（DMD4，5和6）。免疫熒光染色測(cè)定hiPSC的多能性標(biāo)記物OCT4、NANOG和SOX2（圖1B），跳動(dòng)的心肌細(xì)胞確定表達(dá)標(biāo)志蛋白、心肌肌鈣蛋白（cTnT）和α-actinin（圖1C）。免疫熒光（圖1D）和qRT-OCR（圖1E）確定dystrophin的存在與否。

圖1 DMD hiPSC-CMs的產(chǎn)生。（A）hiPSC分化產(chǎn)生hiPSC-CMs的步驟。（B）多能干細(xì)胞標(biāo)志物染色OCT4、NANOG、SOX2。（C）心臟troponin T、α-actinin、DAPI染色。（D）健康和和DMD hiPSC-CMs的dystrophin、心臟troponin T、DAPI染色。（E）hiPSC-CMs中內(nèi)源性dystrophin和utrophin (UTR)表達(dá)水平。

       1 Hz起搏條件下用Fura2測(cè)量以評(píng)估基礎(chǔ)鈣水平。觀察到靜息鈣比率變化增加（圖2A）、峰值鈣比率下降趨勢(shì)（圖2B）、瞬時(shí)振幅下降（圖2C）、除Con2/DMD2外到達(dá)峰值的時(shí)間無(wú)差異（圖2D）、90%鈣瞬變持續(xù)時(shí)間（圖2E）、衰減τ增加（圖2F）。與之前使用Fluo-4方法觀察到的自發(fā)鈣瞬變趨勢(shì)類似。與對(duì)照組相比，DMD hiPSC-CMs表現(xiàn)出鈣瞬變異常，除Con2/DMD2外瞬變幅度降低、到達(dá)峰值的時(shí)間延遲、TD50延長(zhǎng)，但衰減τ沒有差異，與先前在DMD和其他遺傳性擴(kuò)張型心肌病hiPSC-CMs中表征的鈣瞬變類似�？傊�，使用兩種不同的鈣瞬變成像方法證實(shí)了DMD hiPSC-CMs鈣處理異常。

圖2 DMD hiPSC-CMs表現(xiàn)出鈣處理異常。（A）靜息，（B）峰值，（C）瞬移幅度，（D）到達(dá)峰值的時(shí)間，（E）90%鈣瞬變持續(xù)時(shí)間，（F）衰減τ。

02-當(dāng)受到增加的機(jī)械負(fù)荷時(shí)，DMD hiPSC-CMs表現(xiàn)出收縮力產(chǎn)生障礙

       為測(cè)量DMD hiPSC-CMs的收縮力，開發(fā)了一個(gè)牽引力顯微鏡平臺(tái)，使用可調(diào)水凝膠模擬纖維化發(fā)生前（10kPa）和后（35kPa）的心臟組織硬度（圖3A）。通過(guò)微圖案化將單個(gè)hiPSC-CMs構(gòu)建為7:1長(zhǎng)寬比，這是成體心肌細(xì)胞的特征，可促進(jìn)HiPSC-CMs肌節(jié)排列和成熟。牽引力顯微鏡平臺(tái)捕捉單個(gè)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的力，作為水凝膠變形的函數(shù)，通過(guò)跟蹤嵌入的熒光微珠（圖3B），使用傅立葉變換牽引細(xì)胞術(shù)重建牽引應(yīng)力。測(cè)量DMD和10和35kPa水凝膠裝置上培養(yǎng)的健康hiPSC-CMs中，幾個(gè)收縮周期中的收縮參數(shù)，包括力和速度（圖3C。

       35kPa條件下，與對(duì)照組相比，DMD hiPSC-CMs中力的產(chǎn)生顯著減少，但10kPa水凝膠中沒有（圖3D）。35kPa水凝膠上的DMD hiPSC-CMs還顯示收縮速度（圖3E）、舒張速度（圖3F）和細(xì)胞表面積（圖3G）降低，與鈣處理方面的測(cè)量結(jié)果一致。僅在35kPa基質(zhì)上培養(yǎng)的DMD hiPSC-CMs中出現(xiàn)收縮缺陷，這一事實(shí)表明一旦心臟組織經(jīng)歷纖維化硬化（DMD心肌病的一個(gè)標(biāo)志），DMD心肌細(xì)胞就無(wú)法補(bǔ)償dystrophin缺陷。

       實(shí)驗(yàn)測(cè)得基礎(chǔ)條件下，DMD hiPSC-CMs的活性氧（ROS）增加，但線粒體呼吸沒有差異。已知心肌細(xì)胞在心力衰竭條件下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒獯�謝。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下，如僅含葡萄糖、僅含丙酮酸鹽或僅含棕櫚酸鹽，DMD hiPSC-CMs基礎(chǔ)耗氧率和最大耗氧率顯著降低。表明DMD hiPSC-CMs表現(xiàn)出代謝適應(yīng)不良和收縮功能障礙，與DMD心力衰竭進(jìn)展中的觀察結(jié)果類似。

圖3 纖維化微環(huán)境處理下DMD hiPSC-CMs表現(xiàn)出收縮功能障礙。（A）牽引力顯微鏡評(píng)估DMD hiPSC-CMs收縮。（B）10或35kPa水凝膠上單個(gè)hiPSC-CMs產(chǎn)生的收縮力。（C）收縮周期。（D）力，（E）收縮速度，（F）舒張速度和（G）細(xì)胞面積。

03-沒有細(xì)胞分裂情況下的端�？s短

       探究了DMD hiPSC-CMs是否會(huì)表現(xiàn)出端�？s短，與人DMD心臟組織心肌細(xì)胞和mdx4cv/mTRG2心臟組織類似。使用Q-FISH測(cè)量了一段時(shí)間內(nèi)增殖性hiPSCs和分化的hiPSC-CMs的端粒信號(hào)（圖4A和4B）。增值性hiPSCs的端粒信號(hào)與健康對(duì)照和DMD hiPSCs，或三個(gè)等基因?qū)﹂g無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4C）。

       伴隨著衰老過(guò)程中每個(gè)細(xì)胞分裂的不完全復(fù)制，端粒損失通常是一個(gè)“被動(dòng)”過(guò)程。通過(guò)hiPSC-CM平臺(tái)能夠測(cè)試心肌細(xì)胞在沒有DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的情況下是否也會(huì)發(fā)生端�？s短。已知小鼠和人出生后發(fā)育期間，心肌細(xì)胞大多處于有絲分裂后期。通過(guò)EdU摻入法測(cè)定端粒長(zhǎng)度及DNA復(fù)制，評(píng)估了hiPSC-CMs分化的一段時(shí)間，其中第0天被定義為分化的第一天（圖4D、4E）。發(fā)現(xiàn)與DMD小鼠（mdx4cv/mTRG2）和DMD患者結(jié)果一致，DMD hiPSC-CMs端粒較對(duì)照組逐漸縮短，在第30天端粒減少了50%（圖4D）。EdU標(biāo)簽顯示，在第16天仍發(fā)生增殖，但在第20天至第30天之間增殖停止（圖4E）。正是在有絲分裂后的這段時(shí)間里，觀察到DMD hiPSC-CMs端粒與對(duì)照組相比發(fā)生進(jìn)行性減少，最終在第30天減少了約50%（圖4D）。

圖4 DMD hiPSC-CMs表現(xiàn)出端�？s短和DNA損傷應(yīng)答。（A）Q-FISH量化端粒長(zhǎng)度（TelC）。（B）心臟troponin T、TelC、DAPI染色的hiPSC-CMs。（C）Q-FISH量化hiPSC端粒。（D）第20-30天間DMD hiPSC-CMs逐漸出現(xiàn)端粒丟失。（E）第20-30天hiPSC-CMs缺乏EdU。

       假設(shè)端粒縮短的早期分子觸發(fā)因素可能是端粒失去覆蓋的外殼蛋白。研究人員分離了第20天，即非增殖出現(xiàn)端�？s短時(shí)的心肌細(xì)胞，TMRM染色評(píng)估線粒體膜電位，流式細(xì)胞儀富集hiPSC-CMs。qRT-PCR顯示與對(duì)照hiPSC-CMs相比，端�？s短DMD中端粒重復(fù)結(jié)合蛋白（TRF1和TRF2）和shelterin復(fù)合蛋白（RAP1、TIN2和POT1）的轉(zhuǎn)錄水平降低。為確定端�？s短是否激活了DNA損傷應(yīng)答，評(píng)估了p53水平（圖5A）、每個(gè)單細(xì)胞p53結(jié)合蛋白1（53BP1）foci數(shù)（圖5B和5D）和p21水平（圖5C和5E）。發(fā)現(xiàn)DMD hiPSC-CMs中p53蛋白上調(diào)（圖5A），對(duì)照組和DMD組中53BP1陽(yáng)性hiPSCCMs的發(fā)生率從10%增加到50%（圖5）。此外，53BP1的積累與p53下游靶向p21蛋白的表達(dá)相關(guān)（圖5C和5E）。如53BP1升高所示，DNA損傷應(yīng)答的激活誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的PGC-1a抑制，這反過(guò)來(lái)阻礙線粒體生物發(fā)生（圖5F-5H）。另外與健康對(duì)照組相比，DMD hiPSC-CMs中凋亡標(biāo)記物caspase-3和cleaved PARP增加，β-半乳糖苷酶信號(hào)積累增加。當(dāng)從第20天開始每天使用布雷他�。╞lebbistatin）阻斷DMD hiPSC-CM收縮，通過(guò)控制劑量將肌球蛋白頭部鎖定在低親和力狀態(tài)，從而防止actin結(jié)合，發(fā)現(xiàn)端�？s短終止了，第30天測(cè)量確定確實(shí)如此（圖5I）。表明shelterin基因下調(diào)伴隨著由于異常收縮導(dǎo)致的非細(xì)胞分裂的端粒縮短，引起p53依賴的DNA損傷應(yīng)答。

圖5 DMD hiPSC-CMs中p53上調(diào)。（A）p53激活的western圖像。（B）DNA損傷53BP1 foci的免疫熒光圖像。（C）心臟troponin T陽(yáng)性hiPSC-CMs中的p21。（D, E）p21定量。（F）qRT-PCR測(cè)得PGC-1α（線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子）表達(dá)減少。（G）MitoTracker Green和qRT-PCR測(cè)得的線粒體數(shù)量。（H）線粒體拷貝數(shù)量。（I）第20-30天使用布雷他汀抑制DMD hiPSC-CMs收縮時(shí)，可阻止端粒丟失。

結(jié)論

       本研究證明了在含結(jié)構(gòu)蛋白dystrophin突變的hiPSC源心肌細(xì)胞中，端粒會(huì)通過(guò)一種復(fù)制非依賴性機(jī)制進(jìn)行性縮短。已知DMD小鼠模型（mdx4cv）中端粒長(zhǎng)度的人源化可以顯露出擴(kuò)張型心肌病表型，在Noth單倍體不足（Notch+/-）小鼠中科顯露雙尖瓣表型。使用DMD hiPSC疾病模型能夠繪制端�？s短的動(dòng)態(tài)圖，證實(shí)并擴(kuò)展了在鼠和人心臟組織中觀察到的致病過(guò)程。

       文中的DMD hiPSC-CM模型和牽引力顯微鏡在硬水凝膠上的應(yīng)用如實(shí)地概括了DMD患者心肌病的特征。不僅探究了DMD心肌纖維化發(fā)展后期，硬度增加損害DMD hiPSC-CMs收縮功能的機(jī)制，還表明心肌細(xì)胞可以補(bǔ)償健康心臟中dystrophin的缺乏，但無(wú)法補(bǔ)償僵硬、纖維化的心臟，這可以解釋為什么DMD患者隨著年齡的增長(zhǎng)越來(lái)越容易患心律失常和心力衰竭。對(duì)不同硬度微環(huán)境的收縮反應(yīng)的特征表明，DMD心肌細(xì)胞急性機(jī)械功能障礙的發(fā)展與心臟纖維化進(jìn)展是同步的。

       端�？s短的分子觸發(fā)因素可能是shelterin復(fù)合物的丟失。研究發(fā)現(xiàn)DMD心肌細(xì)胞中，shelterin復(fù)合物與端粒的結(jié)合在非增殖性端�？s短開始時(shí)減少，這可能是由于缺乏dystrophin時(shí)的收縮應(yīng)激。鑒于DMD hiPSC-CMs中ROS產(chǎn)生增加約30%，且已知高ROS可以驅(qū)動(dòng)端粒氧化并破壞shelterin結(jié)合，因此可推測(cè)未被覆蓋的端粒重復(fù)序列的直接氧化也可能參與端�？s短。雖然研究表明shelterin在DMD hiPSC-CMs中的表達(dá)降低，但仍有待確定shelterin表達(dá)的喪失是DMD心肌細(xì)胞端粒去保護(hù)的原因還是結(jié)果。此外，ROS的產(chǎn)生部分由DMD心肌細(xì)胞收縮活動(dòng)驅(qū)動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)布雷他汀阻礙端粒縮短，表明收縮功能至關(guān)重要，但這是否是由于ROS介導(dǎo)的端粒去保護(hù)或肌節(jié)組織破壞仍有待闡明。盡管如此，這些數(shù)據(jù)仍支持收縮與關(guān)鍵結(jié)構(gòu)收縮蛋白的遺傳缺失是端粒縮短的主要原因。另外DMD hiPSC-CMs中結(jié)構(gòu)完整性的喪失可能會(huì)引發(fā)轉(zhuǎn)錄變化，下游后遺癥包括激活DNA損傷應(yīng)答（53BP1、p53和p21蛋白積累）、線粒體死亡和代謝衰竭，與mTRG4小鼠衰老模型和DMD小鼠“人源化”端粒模型（mdx4cv/mTRG2）一致。

       DMD hiPSC-CMs獲得“衰老樣狀態(tài)”是由于53BP1、p53、p21和β-半乳糖苷酶的表達(dá)。雖然端粒長(zhǎng)度在心肌病發(fā)病機(jī)制中非常關(guān)鍵，但DNA損傷應(yīng)答可能會(huì)破壞對(duì)細(xì)胞存活重要的其他途徑，如抑制線粒體生物發(fā)生相關(guān)的PGC-1α。

       總之，研究表明營(yíng)養(yǎng)不良的心肌細(xì)胞中，端�？s短的發(fā)生與增殖無(wú)關(guān)，并且可能由收縮誘導(dǎo)的ROS驅(qū)動(dòng)。這提出了一個(gè)治療靶點(diǎn)，端粒維持，對(duì)改善或阻止DMD心肌病進(jìn)展有很大推進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)：

Chang, Alex C. Y. , et al. "Increased tissue stiffness triggers contractile dysfunction and telomere shortening in dystrophic cardiomyocytes." (2021).