臺(tái)盼藍(lán)排除法目前得到美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）的認(rèn)可，是細(xì)胞治療中總細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)。然而，隨著細(xì)胞治療的發(fā)展，對(duì)于復(fù)雜的細(xì)胞樣本如免疫細(xì)胞、原代細(xì)胞和干細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)方法的局限性越來(lái)越明顯，其特點(diǎn)是高估了細(xì)胞活力、紅細(xì)胞污染等。
 

為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法被引入。這些技術(shù)利用選擇性靶向細(xì)胞核的熒光染料，不受碎片或紅細(xì)胞的影響，確保細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力評(píng)估更加精確。工業(yè)生產(chǎn)上迫切需要擴(kuò)大基于熒光的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器的使用，以加快研發(fā)速度和生產(chǎn)效率。
 

意識(shí)到這些局限性，韓國(guó)食品藥品安全部（MFDS）更新了其細(xì)胞治療產(chǎn)品指南，支持使用帶有熒光核染色的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。NanoEnTek處于前沿，提供全系列先進(jìn)的自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。
 

NanoEnTek 的產(chǎn)品系列包括 ADAM™ MC2/CellT 和ADAM™ MC Plus/CellT Plus。此外，NanoEnTek 還提供先進(jìn)的 3 熒光通道細(xì)胞分析儀 ADAMII™ LS/CDx。對(duì)于需要高通量和高精度的用戶，NanoEnTek 的高通量雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀EVE™ HT FL 脫穎而出，尤其適用于細(xì)胞治療研究和制造。有了這些先進(jìn)的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，熒光細(xì)胞核染色方法為評(píng)估細(xì)胞治療過(guò)程中的細(xì)胞活力提供了更可靠、更高效的支撐。

1. 現(xiàn)行美國(guó) FDA 和 EMA 指南
目前，美國(guó) FDA 和 EMA 認(rèn)可臺(tái)盼藍(lán)排除法（手動(dòng)和自動(dòng)）作為細(xì)胞治療質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，這種方法具有局限性，使其不太適合復(fù)雜的細(xì)胞治療。例如，與基于熒光的方法相比，基于臺(tái)盼藍(lán)的活力往往高估了細(xì)胞活力，樣品中存在的紅細(xì)胞使總細(xì)胞計(jì)數(shù)不可靠，而基于臺(tái)盼藍(lán)的手動(dòng)計(jì)數(shù)本質(zhì)上是主觀的，并且更具可變性。為了解決這個(gè)問(wèn)題，監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)部分批準(zhǔn)了基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。

從工業(yè)角度來(lái)看，擴(kuò)大基于熒光的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器的使用需求不斷增長(zhǎng)。這樣做不僅可以加快研發(fā)過(guò)程，還可以提高生產(chǎn)效率。將批準(zhǔn)范圍擴(kuò)大到包括自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以大大提高細(xì)胞治療生產(chǎn)的質(zhì)量和效率。

2. 傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的局限性：臺(tái)盼藍(lán)排除法
（1）臺(tái)盼藍(lán)排除法的定義
臺(tái)盼藍(lán)排除測(cè)定是測(cè)定細(xì)胞活力的最早和最常用的方法之一。臺(tái)盼藍(lán)（偶氮染料）染色機(jī)制背后的原理是基于細(xì)胞膜的差異通透性。

活細(xì)胞具有完整且功能性的細(xì)胞膜，可選擇性地允許某些分子通過(guò)。臺(tái)盼藍(lán)顆粒由于其大小和電荷，可以滲透到無(wú)活力細(xì)胞受損或受損的膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)空間。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境尤其是細(xì)胞質(zhì)，由活躍的過(guò)程維持，例如在健康細(xì)胞的情況下，ATP 依賴性離子泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些細(xì)胞利用 ATP 能量，通過(guò)稱為胞吐作用的過(guò)程主動(dòng)擠出臺(tái)盼藍(lán)顆粒，有效地從細(xì)胞內(nèi)空間去除染料并防止細(xì)胞被染色。

相反，無(wú)活力或死細(xì)胞缺乏產(chǎn)生 ATP 的能力，因此無(wú)法進(jìn)行胞吐作用。結(jié)果，它們將臺(tái)盼藍(lán)染料保留在細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致它們?cè)陲@微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色或染色。

通過(guò)使用這種染色方法，研究人員可以直接識(shí)別和計(jì)數(shù)給定群體中的活細(xì)胞（未染色）和死細(xì)胞（藍(lán)色）。
 

（2）臺(tái)盼藍(lán)排除法的局限性
過(guò)去，基于細(xì)胞的研究主要利用永生化細(xì)胞系，例如 CHO 細(xì)胞。然而隨著細(xì)胞治療領(lǐng)域的發(fā)展，正在使用更復(fù)雜的樣本類型，包括原代細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞（PBMC）、干細(xì)胞、解離的腫瘤細(xì)胞，甚至工程化的 T 細(xì)胞。這些細(xì)胞的大小、形狀和聚集特性各不相同，因此傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)排除法在獲得準(zhǔn)確結(jié)果方面并不完全可靠，尤其是對(duì)于 PBMC、干細(xì)胞和原代細(xì)胞等異質(zhì)性樣品。
 

以下是臺(tái)盼藍(lán)排除法的一些局限性：
 

首先，臺(tái)盼藍(lán)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有毒。即使是活細(xì)胞最終也會(huì)被臺(tái)盼藍(lán)染色，因?yàn)橛卸救玖蠒?huì)滲透到細(xì)胞膜中，導(dǎo)致細(xì)胞在接觸后約 5 至 30 分鐘死亡。因此，必須在染料引入后 3 至 5 分鐘內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。此外，臺(tái)盼藍(lán)為致癌物，不僅對(duì)細(xì)胞有害，而且對(duì)人類有害，長(zhǎng)期接觸后可能導(dǎo)致癌癥。

此外，臺(tái)盼藍(lán)可以將死細(xì)胞的形態(tài)改變，可能導(dǎo)致對(duì)活力的高估。用臺(tái)盼藍(lán)染色后，細(xì)胞立即開(kāi)始破裂，成為彌漫性物體。臺(tái)盼藍(lán)染色后，一些死細(xì)胞可能會(huì)消失，導(dǎo)致總細(xì)胞計(jì)數(shù)不足，從而高估細(xì)胞活力。換句話說(shuō)，臺(tái)盼藍(lán)的毒性會(huì)隨著時(shí)間的推移改變活力，從而影響測(cè)量準(zhǔn)確性，從而導(dǎo)致低估細(xì)胞群活力。
 

這些不準(zhǔn)確之處可能會(huì)影響細(xì)胞治療的結(jié)果，細(xì)胞治療依賴于對(duì)免疫細(xì)胞的準(zhǔn)確測(cè)量，這些免疫細(xì)胞將被輸回患者體內(nèi)，此外，突出了對(duì)改進(jìn)解決方案的需求，例如熒光細(xì)胞核染色法。

3. 細(xì)胞治療生產(chǎn)過(guò)程中熒光核染色方法的必要性
在細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)中，從人體血液中提取各種免疫細(xì)胞。然而這些細(xì)胞經(jīng)常被紅細(xì)胞污染，當(dāng)使用傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)排除方法時(shí)，紅細(xì)胞可能會(huì)被錯(cuò)誤地識(shí)別為死細(xì)胞。這種污染延伸到細(xì)胞碎片和非細(xì)胞顆粒，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差。此外，在免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中，與 PBMC 混合的紅細(xì)胞無(wú)法區(qū)分，導(dǎo)致總細(xì)胞計(jì)數(shù)值不準(zhǔn)確。這些不準(zhǔn)確之處會(huì)顯著影響各種免疫細(xì)胞治療（如 CAR-T 和 NK 細(xì)胞治療）的研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)，最終影響基于細(xì)胞的治療的整體質(zhì)量。

此外，與永生化細(xì)胞系相比，從血液、組織或器官中提取的原代細(xì)胞會(huì)帶來(lái)類似的問(wèn)題，因?yàn)樗槠�的存在相�?duì)較高。這可能導(dǎo)致碎片被錯(cuò)誤地計(jì)數(shù)為細(xì)胞，進(jìn)一步加劇了總細(xì)胞計(jì)數(shù)的不準(zhǔn)確性，并降低了基于細(xì)胞的療法的研究、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和制造的質(zhì)量。

此外，基于臺(tái)盼藍(lán)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的局限性也延伸到其對(duì)細(xì)胞存活率的影響。總細(xì)胞計(jì)數(shù)值的不一致和不準(zhǔn)確直接影響細(xì)胞活力評(píng)估。例如，在明場(chǎng)顯微鏡下檢查時(shí)，免疫細(xì)胞（如 PBMC）中豐富的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞活力變異系數(shù)（CV %），因?yàn)榕c傳統(tǒng)細(xì)胞系（>10μm）相比，它們的尺寸（8μm）更小。

與傳統(tǒng)細(xì)胞系不同，臺(tái)盼藍(lán)染色能夠區(qū)分活細(xì)胞（未染色）和死細(xì)胞（深藍(lán)色），根據(jù)內(nèi)部亮度確定 PBMC 等較小細(xì)胞的活力是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。這一挑戰(zhàn)導(dǎo)致用戶之間存在顯著差異，并且使用傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯微鏡區(qū)分活力的能力較差。

為了緩解這些問(wèn)題，本司推薦具有細(xì)胞核熒光染色技術(shù)的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。這種方法包括對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，以獲得一致和準(zhǔn)確的值，而與細(xì)胞大小無(wú)關(guān)。使用 PI 或 DAPI 等試劑根據(jù)染色細(xì)胞核的存在對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確保準(zhǔn)確性并最大限度地減少外部干擾。

該方法對(duì)永生化細(xì)胞系和從血液、組織或器官中提取的原代細(xì)胞均有效，即使存在碎片或紅細(xì)胞污染，也能提供一致且準(zhǔn)確的結(jié)果。使用基于細(xì)胞核熒光染色的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法可確�？偧�(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測(cè)量的高精度和最小的外部干擾，從而實(shí)現(xiàn)可靠的數(shù)據(jù)采集并促進(jìn)研究、開(kāi)發(fā)和過(guò)程管理。

4. 韓國(guó)：主動(dòng)修改“細(xì)胞治療產(chǎn)品放行測(cè)試指南”
韓國(guó)食品藥品安全部（MFDS）最近對(duì)其“細(xì)胞治療產(chǎn)品放行測(cè)試指南”進(jìn)行了重大更新。此次更新是為了認(rèn)可熒光核染色方法的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，使用這種方法的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀現(xiàn)在被正式認(rèn)可為有效的測(cè)試程序。

該指南的最新版本指出了臺(tái)盼藍(lán)染色方法的局限性，并正式認(rèn)可了同時(shí)使用熒光細(xì)胞核染色法的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。這一發(fā)展是向前邁出的積極一步，它解決了與審批流程相關(guān)的問(wèn)題，并為使用基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行更準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)打開(kāi)了大門(mén)。

隨著指南的修改，NanoEnTek 的自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系列包括ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus、3 熒光通道細(xì)胞分析儀 ADAMII™ LS/CDx 和高通量自動(dòng)雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 EVE™ HT FL，現(xiàn)在可以無(wú)縫集成到細(xì)胞治療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)、制造、生產(chǎn)和臨床試驗(yàn)中。這種基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法被認(rèn)可為有效的檢測(cè)程序，可確保獲得準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)，從而有助于細(xì)胞治療產(chǎn)品的整體質(zhì)量和安全性。
 

5. NanoEnTek 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：細(xì)胞治療開(kāi)發(fā)和制造的理想工具
熒光細(xì)胞核染色方法在細(xì)胞治療產(chǎn)品的制造和質(zhì)量控制中以其高精度和可靠性而著稱。NanoEnTek 的自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系列，包括 ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus 和 ADAMII™ LS/CDx，旨在為總細(xì)胞數(shù)量及其活力提供精確可靠的結(jié)果。

 

ADAM II 系列能夠使用細(xì)胞表面標(biāo)志物 （CD marker） 進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞識(shí)別和絕對(duì)計(jì)數(shù)。此外，EVE™ HT FL 是一款高通量熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，可在短短 3 分鐘內(nèi)處理多達(dá) 48 個(gè)樣品。這種卓越的精度和速度使 EVE™ HT FL 成為廣泛應(yīng)用的理想選擇，包括細(xì)胞系和原代細(xì)胞的分析。
 

ADAM™ 系列、ADAMII™ 系列和 EVE™ HT FL 是非常適合用于細(xì)胞治療的設(shè)備。它們具有高準(zhǔn)確性、可靠性和效率，使其成為細(xì)胞治療領(lǐng)域研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)工藝不可或缺的工具。

參考文獻(xiàn)：
1. Cai Y, Prochazkova M, Kim YS, Jiang C, Ma J, Moses L, Martin K, Pham V, Zhang N, Highfill SL, Somerville RP, Stroncek DF, Jin P. Assessment and comparison of viability assays for cellular products. Cytotherapy. 2024 Feb;26(2):201-209. doi: 10.1016/j.jcyt.2023.11.008. Epub 2023 Dec 11. PMID: 38085197; PMCID: PMC10872314.
2. Council of Europe. Nucleated cell count and viability (2.7.29). European Pharmacopoeia, 10th, 2019: 297-9.
3. Mascotti K, McCullough J, Burger SR. HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion. 2000 Jun;40(6):693-6. doi: 10.1046/j.1537-2995.2000.40060693.x. PMID: 10864990.
4. Chan LL, Rice WL, Qiu J. Observation and quantification of the morphological effect of trypan blue rupturing dead or dying cells. PLoS One. 2020 Jan 24;15(1):e0227950. doi: 10.1371/journal.pone.0227950. PMID: 31978129; PMCID: PMC6980413.
5. Kim JS, Nam MH, An SS, Lim CS, Hur DS, Chung C, Chang JK. Comparison of the automated fluorescence microscopic viability test with the conventional and flow cytometry methods. J Clin Lab Anal. 2011;25(2):90-4. doi: 10.1002/jcla.20438. PMID: 21437999; PMCID: PMC6647696.