前言

基于熒光染色的細(xì)胞活力檢測法可用于評(píng)估哺乳動(dòng)物細(xì)胞的活力。同時(shí)使用兩種熒光染料可以對(duì)活細(xì)胞群和死細(xì)胞群進(jìn)行雙色區(qū)分。在本應(yīng)用指南中，我們介紹了一種使用二乙酸熒光素（FDA）和碘化丙啶（PI）的染色方案，它們可分別對(duì)存活細(xì)胞和死亡細(xì)胞進(jìn)行染色。染色方案適用于貼壁細(xì)胞、嵌入細(xì)胞外基質(zhì)的單細(xì)胞和3D細(xì)胞簇，例如細(xì)胞球狀體。

實(shí)驗(yàn)原理

在生物學(xué)研究中，F(xiàn)DA（二乙酸熒光素）和PI（碘化丙啶）被用作活/死細(xì)胞的染色劑。FDA 能夠被細(xì)胞吸收，并在酯酶的作用下，無熒光的 FDA 可被轉(zhuǎn)化為帶綠色熒光的代謝物熒光素。這種轉(zhuǎn)化過程可以作為細(xì)胞活力的指標(biāo)，因?yàn)樗�依賴于活�?xì)胞內(nèi)的酯酶活性。

與之相對(duì)，PI 作為一種細(xì)胞核染色染料，它無法穿越活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜。然而，當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，PI能夠通過這些無序的區(qū)域進(jìn)入細(xì)胞核，并與 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

• 二乙酸熒光素（FDA）

將 5 mg FDA 溶解在 1 mL 丙酮中，配制得 FDA 儲(chǔ)存液（儲(chǔ)存液需 -20 °C 保存）

• 碘化丙啶

將 2 mg PI 溶于 1 mL PBS（ 4 °C 儲(chǔ)存），配制得 PI 原液。

• 不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基

• 磷酸鹽緩沖液或其他緩沖液

• 帶 Texas Red 和 FITC 濾片的倒置熒光顯微鏡

 

染色步驟

為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，染色體系應(yīng)即配即用，且其有效使用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制在 2 h 以內(nèi)。在非使用時(shí)段，為確保染色體系的穩(wěn)定性和有效性，應(yīng)將其避光保存，并置于 4°C 恒溫條件下進(jìn)行保存。

圖 1：二乙酸熒光素/碘化丙啶染色體系

針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的染色步驟

對(duì)于粘附在培養(yǎng)表面或嵌入細(xì)胞外基質(zhì)中的單細(xì)胞，建議采用以下染色方案：

1. 根據(jù)圖1所示之配方，準(zhǔn)確配制染色體系，并將其存放在 4 ℃ 冰箱中冷藏；
2. 將細(xì)胞離心后棄上清（去除細(xì)胞培養(yǎng)基）；
3. 加入染色體系——其體積應(yīng)基于所用載玻片或培養(yǎng)皿的尺寸和規(guī)格確定（請(qǐng)參考相應(yīng)的產(chǎn)品規(guī)格說明）；
4. 在室溫下避光孵育細(xì)胞 4~5 min；
5. 將細(xì)胞離心后棄上清（去除染色體系）；
6. 用適量磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗樣本，以去除殘留的染色體系；
7. 加入 PBS 或不含胎牛血清的培養(yǎng)基；
8. 使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

針對(duì) 3D 細(xì)胞培養(yǎng)的染色步驟

以下方案適用于 3D 細(xì)胞培養(yǎng)，如細(xì)胞球狀體、組織等：

1. 根據(jù)圖1所示之配方，準(zhǔn)確配制染色體系，并將其存放在 4 ℃ 冰箱中冷藏；

2. 收集細(xì)胞團(tuán)；如有必要，將細(xì)胞培養(yǎng)體系離心后棄上清，以收集細(xì)胞團(tuán)；

3. 離心后棄上清；

4. 精確加入 1 mL 染色體系；

5. 在室溫下避光孵育細(xì)胞 4~5 min；

6. 將細(xì)胞離心后棄上清（去除染色體系）；

7. 用適量磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗樣本，以去除殘留的染色體系；

8. 加入 PBS 或不含胎牛血清的培養(yǎng)基；

9. 將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至 ibidi µ-Slide 8 孔腔室載玻片中（ibidi, 80826）；

10. 使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

    

    ibidi, 80826

常見實(shí)驗(yàn)問題

1.信號(hào)弱

針對(duì)信號(hào)弱的問題，建議根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況調(diào)整染料濃度或延長孵育時(shí)間。同時(shí)，務(wù)必確保染色液的使用時(shí)間不超過兩小時(shí)，以保持其活性。另外，建議將染色液儲(chǔ)存于 4°C 的避光環(huán)境中。

2.背景信號(hào)高

高背景信號(hào)可能由培養(yǎng)基成分引起，這些成分可能干擾熒光信號(hào)的檢測。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，推薦使用不含血清的培養(yǎng)基。另外，可嘗試使用無酚紅培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液（PBS）作為替代。在除去染色液后，增加額外的清洗步驟有助于降低背景信號(hào)的干擾。

3.光漂白效應(yīng)

熒光信號(hào)可能因光漂白效應(yīng)而隨時(shí)間減弱。因此，快速操作對(duì)于保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性和可重復(fù)性至關(guān)重要。在處理大量樣品時(shí)，建議分批次進(jìn)行染色，每次僅處理有限數(shù)量的樣品。為確保細(xì)胞的最佳生長條件，建議使用 ibidi 載物臺(tái)培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

ibidi 載物臺(tái)培養(yǎng)箱
 

應(yīng)用示例

1.對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色
貼壁細(xì)胞系 MDA-MB-231 的活力染色顯示細(xì)胞活力很高（從左到右：相差顯微鏡鏡檢（明場）圖像、示 PI 信號(hào)圖像、示 FDA 信號(hào)圖像、FDA 和 PI 信號(hào)的疊加場圖像）比例尺：200 μm。
對(duì)包埋在膠原基質(zhì)膠中的 Jurkat 細(xì)胞進(jìn)行活力染色，結(jié)果顯示細(xì)胞活力為 65%。(A：相差顯微鏡鏡檢（明場）圖像；B：示 PI 信號(hào)圖像；C：示 FDA 信號(hào)圖像；D：FDA 和 PI 信號(hào)的疊加場圖像）比例尺：200 μm。

2.對(duì)細(xì)胞球狀體進(jìn)行染色

MCF-7 細(xì)胞球狀體的活力染色（從左到右：相差顯微鏡鏡檢（明場）圖像、示 PI 信號(hào)、示 FDA 信號(hào)、FDA 和 PI 信號(hào)的疊加場圖像）比例尺：200 μm。
 

MCF-7 細(xì)胞球狀體的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像顯示了球狀體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)：壞死的中心被一層有活力的細(xì)胞包圍（從左到右：示 PI 信號(hào)圖像、示 FDA 信號(hào)圖像、FDA 和 PI 信號(hào)的疊加場圖像）。標(biāo)尺：200 μm

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