細(xì)胞遷移在許多復(fù)雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細(xì)胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：當(dāng)在匯合細(xì)胞單層上產(chǎn)生人工時(shí)，所產(chǎn)生的間隙邊緣上的細(xì)胞將遷移直至建立新的細(xì)胞。ibidi Culture-Insert系列為傷口愈合實(shí)驗(yàn)提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個(gè)步驟。

 

 

本應(yīng)用介紹是使用ibidiCulture-Insert 2 Well分析MCF-7細(xì)胞遷移行為的詳細(xì)方案。

圖1.使用ibidi Culture-Insert 2 Well進(jìn)行傷口愈合測定的實(shí)驗(yàn)工作流程

ibidi Culture-Insert 2Well放置在細(xì)胞培養(yǎng)皿表面上，提供兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器，每個(gè)容室由500μm壁隔開。在兩個(gè)儲庫中填充細(xì)胞懸浮液僅允許細(xì)胞在指定區(qū)域生長。細(xì)胞附著后移除2孔培養(yǎng)插件，產(chǎn)生大約500μm的無細(xì)胞間隙。顯微鏡用于評估傷口愈合過程。根據(jù)您感興趣的焦點(diǎn)，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時(shí)間點(diǎn)觀察圖像來完成。測量細(xì)胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細(xì)胞遷移特征。

實(shí)驗(yàn)工作流程也可以應(yīng)用于Culture-Insert 3 Well和Culture-Insert 4 Well。唯一的區(qū)別是更多的孔和相應(yīng)的更多的無細(xì)胞劃痕。

Culture-Insert 3 Well和Culture-Insert 4 Well

1.  材料

• 細(xì)胞：                              MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ:ACC115)

• 培養(yǎng)耗材:                  2孔插件放在35毫米的培養(yǎng)皿中，高壁（ibidi，                                                      80206）

• 細(xì)胞培養(yǎng)表面：                   ibidi ibitreat

• 細(xì)胞培養(yǎng)基：                    RPMI (西格瑪,R8758) = 10% FCS (西格瑪,  F0804)

• 細(xì)胞解離溶液：                 胰蛋白酶-ETDA（Sigma，59418C）

• 無菌鑷子

• 倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細(xì)胞成像的鏡載培養(yǎng)箱

 

2.實(shí)驗(yàn)工作流程

步驟1：細(xì)胞接種

為了建立可靠的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，您必須在開始實(shí)驗(yàn)之前定義實(shí)驗(yàn)參數(shù)。這包括例如選擇正確的細(xì)胞接種密度。我們建議使用24小時(shí)后產(chǎn)生100％光學(xué)匯合細(xì)胞層的密度。

1. 像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)至合適細(xì)胞濃度。在24小時(shí)后獲得3×105細(xì)胞/ ml以獲得匯合的細(xì)胞層。

2. 將70μl細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于Culture-Insert2孔的每個(gè)孔中。避免搖動μ-Dish，因?yàn)檫@會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

3.將細(xì)胞在37°C和5％CO2下孵育至少24小時(shí)

圖2在ibidi Culture-Insert 2 Well中接種細(xì)胞

第2步：間隙形成

匯合細(xì)胞層是開始該測定的先決條件。去除Culture-Insert 2孔插件后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要，補(bǔ)充培養(yǎng)基中的抑制或增強(qiáng)物質(zhì)，以評估其對細(xì)胞遷移行為的影響。

1.  在顯微鏡下24小時(shí)后檢查細(xì)胞密度。如果在24小時(shí)后沒有達(dá)到匯合的細(xì)胞層，則將μ-Dish再次置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中12-24小時(shí)，定期檢查匯合點(diǎn)。

2.用無菌鑷子輕輕取出Culture-Insert 2孔。如圖3所示，從插件的一角移除

圖3使用無菌鑷子去除ibidi Culture-Insert 2孔
 

3  . 移除插入后，檢查您的細(xì)胞層是否仍附著在μ-Dish的表面上。

4.  用無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS清洗細(xì)胞層，去除細(xì)胞碎片和非附著細(xì)胞。

5.使用推薦體積為2 ml的無細(xì)胞培養(yǎng)基填充μ-Dish

圖4由ibidi Culture-Insert 2 Well創(chuàng)建的無細(xì)胞劃痕
 

3步：獲取顯微圖像

我們建議錄制延時(shí)視頻，以確定時(shí)間依賴性和細(xì)胞遷移的特征。

1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動它直到你有間隙，并在圖像中捕獲兩個(gè)細(xì)胞前端。使用4x / 5x或10x物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

2. 在接下來的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程。

3. 在ibiTreat表面上培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞的時(shí)間推移測量進(jìn)行20小時(shí)，時(shí)間間隔為30分鐘。

圖5使用MCF-7細(xì)胞的遷移測定的不同時(shí)間測量（比例尺：200μm）
 

步驟4：使用ACAS和數(shù)據(jù)解釋進(jìn)行定量圖像分析

 

必須分析顯微照片以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以使用自動圖像分析完成自動細(xì)胞分析系統(tǒng)（ACAS）由ibidi提供。

使用ACAS分析此處顯示的示例數(shù)據(jù)。自動圖像分析檢測細(xì)胞覆蓋區(qū)域。相對于時(shí)間繪制細(xì)胞覆蓋區(qū)域顯示了間隙閉合的過程。線性相可用于表征遷移（=傷口閉合的速度）。

線性相的斜率顯示平均刮擦閉合速度為0.0184×106μm2/小時(shí)（= 0.44×106μm2/天）。

 

圖6 ACAS傷口愈合實(shí)驗(yàn)的定量圖像分析

 

廣州科適特科學(xué)儀器有限公司是德國ibidi公司在中國區(qū)合作伙伴

如果你感興趣請和我們聯(lián)系

電話：020-38102730  

服務(wù)QQ：501747125

郵箱：info@kosterscience.com

地址：廣州市天河區(qū)體育西路駿匯大廈北塔110 D房

關(guān)注微信公眾號及時(shí)獲取最新資訊