細(xì)胞鋪板實(shí)驗主要步驟及注意事項
細(xì)胞鋪板是細(xì)胞實(shí)驗中必須掌握的一門技術(shù)，雖然看起來非常簡單，但卻難以掌握。
很多人經(jīng)常會遇到細(xì)胞中間密或者中間稀疏等「細(xì)胞分布不均勻」的情況。如下圖為：細(xì)胞鋪板時，常出現(xiàn)的細(xì)胞分布不均勻現(xiàn)象。
細(xì)胞鋪板時常出現(xiàn)的細(xì)胞分布不均勻現(xiàn)象
鋪板成功的關(guān)鍵在于對細(xì)胞消化和鋪板方法的正確拿捏和掌握。
（1）細(xì)胞一定要消化好；
（2）鋪板前要混勻，把存在的細(xì)胞團(tuán)盡可能分開。
細(xì)胞鋪板實(shí)驗
主要分為3大步驟：收集細(xì)胞→細(xì)胞計數(shù)→細(xì)胞鋪板。
一、收集細(xì)胞，制作單細(xì)胞懸液
① 吸棄培養(yǎng)皿中的原培養(yǎng)液，用1~2 ml 的PBS洗兩次
② 棄去PBS，加入適量胰酶進(jìn)行消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮、變圓，結(jié)束消化。（不同細(xì)胞消化時間差異較大）
③ 消化完全后，吸取細(xì)胞懸液離心（800 rpm*5 min），棄去上清液，加入適量培養(yǎng)基制得單細(xì)胞懸液（可能需要稀釋，防止細(xì)胞數(shù)太多影響計數(shù)結(jié)果），進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
Tips：
★消化細(xì)胞需要選擇適用的消化液、適當(dāng)?shù)南瘻囟群蜁r間。建議新手或者養(yǎng)的是一個新細(xì)胞時，預(yù)實(shí)驗觀察最佳胰酶消化時間及濃度。
★消化后需要輕輕拍打細(xì)胞貼壁面，震落細(xì)胞。
★一般用1000rpm/min離心即可，離心力太大細(xì)胞容易抱團(tuán)！
★離心后，要充分懸浮。一般先加2mL液體后用1mL移液器輕輕將細(xì)胞吹起（注意不要有氣泡），這樣易于形成單細(xì)胞。此外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力，所以要熟練操作，盡快上板。
二、細(xì)胞計數(shù)
在顯微鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)板，分別記錄 1、2、3、4 每個方格的細(xì)胞數(shù)目，計上不計下，計左不計右。四個方格的細(xì)胞總數(shù)記為 X。因為每個方格的容積為0.1mm3，即0.1×10-3ml，可知細(xì)胞懸液密度C1=（X/4）/（0.1×10-3ml）=(X/4)×104個/ml。如果計數(shù)前進(jìn)行了稀釋且稀釋倍數(shù)為M，則原細(xì)胞懸液密度為C2=(X/4)×M×104個/ml。確定細(xì)胞懸液密度后，再根據(jù)每個孔需添加的細(xì)胞數(shù)及孔數(shù)確定所需加液量。
三、細(xì)胞接種
需要根據(jù)實(shí)驗?zāi)康倪x擇不同規(guī)格的培養(yǎng)板。如在進(jìn)行藥物對待測細(xì)胞半抑制率（IC50）測試時，通常使用96孔板，一方面可以設(shè)置濃度梯度；另外還可一次性測多個藥物，減少實(shí)驗誤差。
NEST細(xì)胞培養(yǎng)板（6孔、12孔、24孔、96孔、384孔）
①稀釋細(xì)胞：根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果后，將細(xì)胞稀釋到目的濃度。
Tips：細(xì)胞密度對于鋪板很重要，過密很容易造成細(xì)胞居中，細(xì)胞濃度過稀會造成細(xì)胞難以生長起來。一般會在實(shí)驗前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗。
②加入細(xì)胞懸液
為防止表面張力導(dǎo)致的中間液面太低細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，通常在每一個孔加少量的無血清培養(yǎng)基，不用太多，浸潤孔底即可。一般可加一個孔，浸潤，再用移液槍移取，再加入第二個孔，浸潤，依此類推。
如果培養(yǎng)液量少，由于瓶體內(nèi)液體有向邊緣吸的特性，所以造成中間低洼，細(xì)胞容易聚集，可以多加點(diǎn)液體緩解。
然后加入細(xì)胞懸液，從孔的左邊靠近底部貼壁慢慢加入，這樣加液后，細(xì)胞懸液會平鋪在整個孔底，細(xì)胞分散較均勻，可以避免加在中間位置和加在周邊晃勻后周邊細(xì)胞局部太多的現(xiàn)象。
十字搖勻法：
將板放在水平板面上“十字”形搖勻（上下左右四個方向進(jìn)行移動，呈十字形狀，重復(fù)5-6次）。不可以轉(zhuǎn)圈搖，會導(dǎo)致細(xì)胞被帶到中間。
一般來說，“十字搖勻”對于12孔板，24孔板，96孔板中接種細(xì)胞時不怎么適用了。這個時候，我們可以通過輕拍使得細(xì)胞均勻分布。
輕拍搖勻法：
以12孔板為例，在接種細(xì)胞后，合上蓋子，左手大拇指捏住12孔板中間（或者左下角）,保持水平，底和蓋子始終緊緊合上。右手掌輕輕拍打右側(cè)，注意力度，力道太大培養(yǎng)基會濺到蓋子上，力度過小則難以使細(xì)胞混勻，以拍打時培養(yǎng)基來回晃動且不濺出為宜，拍打右側(cè)10次左右。然后拍打前側(cè)，10次左右。這個時候細(xì)胞基本鋪勻了，我們可以在顯微鏡下觀察，細(xì)胞懸液是否均勻分布。如果覺得通過細(xì)胞懸液不容易判斷細(xì)胞是否均勻，可將12孔板放置于顯微鏡載物臺，10分鐘以后細(xì)胞基本沉降，這時再進(jìn)行觀察。如果發(fā)現(xiàn)不勻，就重復(fù)前面操作。
注意，12孔板有6個面，前，后，左，右，上，下。我們只需要拍打兩個面，右側(cè)和后側(cè)。千萬不要每個面都拍打！另外，拍打次數(shù)也可以根據(jù)實(shí)際情況相應(yīng)調(diào)整，結(jié)合鏡下觀察情況，選擇最適宜自己的方式。
搖勻后要放工作臺靜置一下，等細(xì)胞貼壁了，輕輕移入到培養(yǎng)箱中。
Tips：
★用排槍吸取時，一定要保證每個槍頭吸上來的懸液體積一致。
★如果是用于進(jìn)行MTS等長時間測試時，最外圈應(yīng)空余出來（中間60孔為最佳，四周的一圈邊緣孔不接細(xì)胞），加入PBS或細(xì)胞懸液（做空白或陰性對照），以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)引起的邊緣效應(yīng)。
培養(yǎng)箱里面或者外面盡量不要放可以產(chǎn)生振動的儀器，比如蠕動泵、離心機(jī)、渦旋器一類的儀器。這些儀器產(chǎn)生的振動對細(xì)胞貼壁有影響，也可能會導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不均勻。
其實(shí)細(xì)胞鋪板不一定都需要單個單個的那么均勻。
★免疫熒光時，就可以選擇鋪中間少，周圍稍多的板子。
★在提取蛋白或者提取RNA的時候有時會選擇鋪中間多，四周少的板子，因為有些細(xì)胞刮刀不好用，沒有辦法刮到周圍的。
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