軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實(shí)驗(yàn)(Anehorage-independentassay），利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長。

軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。

細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，主要反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。

Part 01. 實(shí)驗(yàn)材料
 

Part 02. 實(shí)驗(yàn)操作流程

上圖我們看到3株癌細(xì)胞在6孔板克隆形成圖片，第一個(gè)明顯鋪板細(xì)胞太密集，導(dǎo)致難以統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；中間那個(gè)正好，最后面那個(gè)細(xì)胞數(shù)量偏少，且細(xì)胞鋪板不均勻。因此，為了獲得美觀的圖片和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，第一次實(shí)驗(yàn)最好設(shè)置細(xì)胞接種梯度，如500-1000-2000-5000個(gè)/孔挑選出最合適的接種密度。細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度，否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到很大影響；另外注意細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)建議多計(jì)數(shù)幾次。

Q：細(xì)胞接種后培養(yǎng)的時(shí)間，如何確定？
A：通常情況下，單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上所組成的細(xì)胞群稱為一個(gè)陽性克隆，時(shí)間約為一周；但具體時(shí)間因細(xì)胞增殖能力而已異，因此應(yīng)密切關(guān)注細(xì)胞生長情況，隔天在顯微鏡下觀察克隆情況，若單個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)到達(dá)50個(gè)左右即可固定細(xì)胞。