——大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)——

細(xì)胞工廠升級劇集片

第二期
 

上期說到，耐思細(xì)胞工廠是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置， 可用于如細(xì)胞與基因治療、疫苗或干細(xì)胞領(lǐng)域等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，適合于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，線性放大不會改變細(xì)胞生長的動力學(xué)條件。
細(xì)胞工廠在各行各業(yè)究竟起到了什么樣的作用呢？
細(xì)胞工廠應(yīng)用于哪個階段呢？
如何操作才能發(fā)揮細(xì)胞工廠的價(jià)值呢？
 

細(xì)胞工廠擴(kuò)大化培養(yǎng)之操作手冊篇

正在加載......

一、應(yīng)用方向

01 細(xì)胞與基因治療
細(xì)胞與基因治療是指載體治療，是一種將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入靶細(xì)胞、修飾或操縱基因的表達(dá)、改變細(xì)胞的生物學(xué)特性，從而達(dá)到治療效果的新興治療方式。
如何將目的基因或者細(xì)胞安全有效地傳送到人體內(nèi)成為這一療法需要突破的重要瓶頸。一般需要借助病毒作為載體，如腺病毒、腺相關(guān)病毒以及慢病毒。
以研發(fā)為目的的小規(guī)模生產(chǎn)是采用生長在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠的貼壁細(xì)胞。當(dāng)轉(zhuǎn)向臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)會需要大量的慢病毒載體，這個時(shí)候就需要用到細(xì)胞工廠，一般10層細(xì)胞工廠應(yīng)用較多。
02 疫苗產(chǎn)業(yè)
疫苗在人類疾病防控中具有不可替代的作用，如何實(shí)現(xiàn)疫苗經(jīng)濟(jì)、高效且安全的大規(guī)模生產(chǎn)，一直是業(yè)內(nèi)考慮的重點(diǎn)。
隨著生物技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新發(fā)展，疫苗種類呈現(xiàn)多元化發(fā)展態(tài)勢，除了滅活疫苗、減毒活疫苗、重組蛋白疫苗等我們熟知的類型外，病毒載體疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗等新型疫苗陸續(xù)出現(xiàn)。
目前，細(xì)胞工廠已廣泛應(yīng)用于新冠疫苗、口服脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗[1]、凍干甲型肝炎減毒活疫苗[2]、麻腮風(fēng)疫苗[3]、口服輪狀病毒活疫苗[4]、水痘疫苗[5]等的工業(yè)化生產(chǎn)。
03 干細(xì)胞領(lǐng)域
干細(xì)胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細(xì)胞。根據(jù)美國臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫clinicaltrials.gov顯示，目前全球與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的臨床試驗(yàn)有1300多項(xiàng)，已獲批上市的干細(xì)胞新藥14款。利用細(xì)胞工廠進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞、多功能干細(xì)胞的工藝放大，是干細(xì)胞研究中的重要步驟。                             

二、操作手冊

01正確操作步驟

常規(guī)十層細(xì)胞工廠操作方法
1. 將準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基倒入細(xì)胞工廠。（建議每層加入的體積為150-200mL）
2. 將細(xì)胞工廠側(cè)放，使液面平衡。
3. 液口朝上，靜置后培養(yǎng)液平均分配到每一層。
4. 緩慢將細(xì)胞工廠放至水平位置。
5. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。
                                     

帶管路十層細(xì)胞工廠操作方法
1.將進(jìn)液管路上的軋帶剪掉。
2.根據(jù)需求可在進(jìn)液管路上加上管夾，將進(jìn)液管路末端和儲液瓶的出液管路通過無菌接管機(jī)進(jìn)行連接。
3.加入細(xì)胞懸液，將進(jìn)液管路上的管夾關(guān)閉。儲液瓶中的培養(yǎng)基或細(xì)胞懸液可利用重力虹吸原理或使用蠕動泵將細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞工廠，操作過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。
4.將細(xì)胞工廠側(cè)放，使液面平均分配到每層，進(jìn)液管路側(cè)朝下，空氣濾器側(cè)朝上，避免液體進(jìn)入到空氣濾器中。
5.順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90℃，使加液口朝上，靜置后液體平均分配到每一層。
6.緩慢將細(xì)胞工廠放至水平位置,整理好進(jìn)液管路，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：
1.請?zhí)崆皩⒓?xì)胞工廠和培養(yǎng)基預(yù)熱至培養(yǎng)溫度∶由于大的培養(yǎng)器要達(dá)到設(shè)定的培養(yǎng)溫度需要很長時(shí)間，所以在實(shí)驗(yàn)開始前，將細(xì)胞工廠和培養(yǎng)基預(yù)熱至培養(yǎng)溫度，可加快細(xì)胞貼壁，并顯著提高細(xì)胞回收率。
2.請緩慢操作，避免大幅晃動產(chǎn)生氣泡∶ 氣泡可能導(dǎo)致培養(yǎng)基從上層流到下層。
3.避免酒精噴灑到透氣蓋上，酒精可能會濕潤疏水濾膜，導(dǎo)致不能透氣影響氣體交換或?qū)е虏僮鲿r(shí)不能平衡壓力。
 
02觀察細(xì)胞方法
一般使用倒置顯微鏡對細(xì)胞工廠中細(xì)胞的存活率和生長狀況進(jìn)行監(jiān)測。細(xì)胞工廠中各層之間或同一層之間的培養(yǎng)環(huán)境基本相同，因此可以通過觀察底部一兩層或同一層之間的邊緣細(xì)胞狀態(tài)，來判斷整體細(xì)胞工廠中細(xì)胞的狀態(tài)。
常規(guī)的倒置顯微鏡受制于上光源和載物臺之間的高度，一般只能用于1層、2層或5層細(xì)胞工廠的觀察；對于10層的細(xì)胞工廠，就需要增加上光源和載物臺之間的高度，使其可以適配細(xì)胞工廠的高度；對于更大的40層的細(xì)胞工廠，人手操作有困難，一般需要大型設(shè)備進(jìn)行電動化、自動化的觀察。
 

03收獲細(xì)胞指南
1.培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液倒出。
2.使用無鈣無鎂磷酸鹽緩沖液（CMF-PBS）清洗（40-50 mL/層），若有需要重復(fù)清洗一次。 
3.消化∶消化液（10-40 mL/層）提前預(yù)熱。
4.收集∶ 1000 rpm 離心5分鐘，去除消化液，收集細(xì)胞。 
5.清洗∶用CMF-PBS或培養(yǎng)基清洗消化過的培養(yǎng)器。

注意事項(xiàng)：
1.確保CMF-PBS完全浸過每層培養(yǎng)面，并輕輕前后晃動細(xì)胞工廠，將殘留的培養(yǎng)液清洗干凈。 
2.消化液平均分布到每層，輕輕前后左右傾斜培養(yǎng)器，確保消化液完全浸過培養(yǎng)面，輕輕拍擊培養(yǎng)器幫助細(xì)胞從表面脫離。
3.對于細(xì)胞工廠，由于不能清晰觀察中間層的細(xì)胞消化狀態(tài)，建議參照完全相同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)瓶或單層細(xì)胞工廠的消化狀態(tài)。亦可使用專用的多層細(xì)胞培養(yǎng)器觀察臺來觀察每層細(xì)胞的消化狀態(tài)。
4.若清洗液或者是細(xì)胞工廠培養(yǎng)層存在大量細(xì)胞，則需要清洗多次或調(diào)整細(xì)胞消化的操作。
5.培養(yǎng)溫度的一點(diǎn)點(diǎn)偏差都可能影響到細(xì)胞的收獲率，需密切關(guān)注培養(yǎng)的溫度是所設(shè)定的溫度。

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參考文獻(xiàn)：
[1]王紅燕.張晉.金歌.佟丁丁.沈莉.鄭小濱.柯偉華.中國生物制品學(xué)雜志,細(xì)胞工廠在制備口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗中的應(yīng)用,2014
[2]仲宇航.劉景曄.周妍.孫穎.張立志.戰(zhàn)永生.李銳.王云霞.蘇宇.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,細(xì)胞工廠制備凍干甲型肝炎減毒活疫苗的研究,2012,8
[3]付永其.劉輝.孫雅.宋艷梅.張穎欣.律苗.楊云凱.申亞楠.高靜.中國生物制品學(xué)雜志,細(xì)胞工廠在麻腮風(fēng)系列疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用,2018,10
[4]任雅萍.劉學(xué)平.龐興.謝澎.魏至棟.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,細(xì)胞工廠生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗的應(yīng)用研究,2011,4
[5]周翎喬.周鋒.孫世杰.彭曉.楊月蓮.王亮.謝蕾.馬相虎.中國新藥雜志,細(xì)胞工廠在水痘疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用,2012,10