圖 1C，使用ibidi 泵系統(tǒng)灌注培養(yǎng) 14 天后，L929 球體在 µ-Slide 球體灌注、Bioinert中的活/死 FDA/PI 染色，0.75 毫升/分鐘。綠色：活細胞（熒光素二乙酸酯，F(xiàn)DA）；紅色：死細胞（碘化丙錠，PI）。寬場熒光顯微鏡，10 倍物鏡。

在建立細胞培養(yǎng)模型以研究細胞功能、特定疾�。ɡ�如癌癥）或表征某些藥物之前，研究人員必須考慮這些因素。為了獲得最接近體內(nèi)的實驗結果，盡可能接近地模擬活體組織的生理條件也是有意義的。

在這篇文章中，我們介紹了不同的 3D 細胞培養(yǎng)模型來研究類似體內(nèi)狀態(tài)的細胞。

從單層細胞到組織：

雖然細胞仍然主要在經(jīng)細胞培養(yǎng)處理的塑料表面或涂有蛋白質或厚細胞基質（2.5D 培養(yǎng)）的 2D 單層細胞中培養(yǎng)，但如果您有興趣在更廣泛的環(huán)境中培養(yǎng)細胞，則可以從各種 3D 細胞培養(yǎng)模型中進行選擇生理方式（圖2）。

可以使用基于支架的技術，例如聚合物或水凝膠，它們通過合成化學聚合物或蛋白質網(wǎng)絡提供結構支持�；蛘撸�可以使用無支架技術獲得3D細胞結構，其中可以在沒有額外結構支持的情況下形成復雜的細胞聚集體或整個組織。
 

圖 2：2D 和 3D 細胞培養(yǎng)模型概述。

在決定哪種技術最適合各自的研究問題時，應考慮這兩種方法的優(yōu)缺點。支架方法考慮了細胞與 ECM 的相互作用，而細胞的環(huán)境可以用懸浮生長的球體更好地操縱。為了在顯微鏡上長期培養(yǎng)和研究 3D 結構，已經(jīng)開發(fā)了特殊的工具和技術，以確保在較長時間內(nèi)持續(xù)提供培養(yǎng)基和模擬生理條件。

基于支架的 3D 細胞培養(yǎng)模型：

3D 細胞培養(yǎng)模型的支架范圍從多孔聚合物膜到模擬 ECM 細胞微環(huán)境的復雜水凝膠。

一般來說，水凝膠形成交聯(lián)聚合物的結構，可以吸收和結合大量的水。在 4°C 或室溫下，混合物是液體，但在 37°C 下會形成凝膠。此功能使得可以將液體與細胞混合，然后在 37° 下孵育時將細胞嵌入三維矩陣中。這允許細胞保留特定的體內(nèi)特征,例如細胞-ECM 相互作用或環(huán)境的生理和機械特性。

有不同類型的水凝膠，例如 Matrigel ®或 膠原蛋白，它們來自有機來源。然后，復雜的合成水凝膠具有精確控制其成分（分子、交聯(lián)劑等）的優(yōu)勢。這允許對各個組件的影響得出不同的結論。

無支架 3D 細胞培養(yǎng)模型：

獨立于支架的方法允許在沒有矩陣支持的情況下以 3D 方式培養(yǎng)細胞。它們依賴于細胞自組裝成聚集體或球狀體的概率。建立了多種技術來促進這種自組裝過程。

圖 3：在µ-Slide 4 Well中培養(yǎng)的纖維蛋白水凝膠中發(fā)芽的人腸成纖維細胞和內(nèi)皮細胞球體。內(nèi)皮細胞用 CD31（黃色）染色，成纖維細胞用波形蛋白（紅色）染色，DNA 用 DAPI（青色）染色。共聚焦圖像由 H. Nogueira Pinto 拍攝，生物工程 3D 微環(huán)境小組，Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S)，Universidade do Porto，葡萄牙。

懸滴技術

懸滴技術是生物學中行之有效的方法，已用于許多不同的應用，例如整個（微生物）生物體的觀察或蛋白質的結晶。它利用重力形成從玻璃板上垂下的懸浮液滴。

在過去的十年中，這項技術已經(jīng)過修改并適用于3D細胞培養(yǎng)應用，允許從細胞懸液中形成球狀體而無需支撐支架（圖 4）。如今，專門的懸滴板已在市場上銷售。然而，雖然這種方法適用于球體的生成，但不可能將其與高分辨率顯微鏡相結合。
 

圖 4：懸滴法原理。

超低吸附 (ULA) 涂層

所謂的低粘附板涂有中性電荷或親水性蛋白質或水凝膠，可減少細胞對板表面的附著，從而形成 3D 細胞結構。雖然這種涂層主要防止細胞附著，但在更長的時間后細胞粘附仍然會發(fā)生，因為涂層通常只是物理吸附而不是共價結合——因此不是長期穩(wěn)定的。

生物惰性表面

與標準 ULA 涂層相比，生物惰性表面共價結合并提供穩(wěn)定的表面鈍化。因此，它可以完全防止蛋白質或細胞附著到涂層表面。這促進了細胞間的相互作用和 3D 細胞聚集體的形成，即使在長期實驗中也是如此（圖 5）。
 

圖 5：ibidi 聚合物蓋玻片上生物惰性表面上的球體形成。

微圖案表面微孔板

 在 Bioinert 表面上壓印微圖案可以使細胞精確粘附在指定位置（圖 6）。µ 圖案斑點周圍的鈍化區(qū)域有助于形成 3D 細胞聚集體和球狀體（圖 7 和 8）。

圖 6：微圖案斑點上細胞附著的動圖。



圖 7：微圖案點上球體形成的原理。