解決方案 | 原代細(xì)胞分離提取方法及注意事項
 

原代細(xì)胞是直接取自活組織的細(xì)胞，并用于體外生長。這些細(xì)胞經(jīng)歷了非常少的群體倍增，因此與連續(xù)(腫瘤或人工永生化)細(xì)胞系相比，它們更能代表它們所衍生組織的主要功能成分，使得原代細(xì)胞成為更具代表性的體內(nèi)模型。

原代細(xì)胞分離是指將組織分散制成細(xì)胞懸液后從中獲取目的細(xì)胞的過程，獲得高純度、高活性的原代細(xì)胞則是很多細(xì)胞實驗成功的關(guān)鍵要素之一，原代細(xì)胞分離的方法有很多種：懸浮離心法、直接組織塊法、酶消化法、非酶消化法、機械分散法等。

人或動物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，即使采用1mm3 的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來

常采用的方法如下：

1. 懸浮細(xì)胞的分離方法

組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。

 2.實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。

(一)機械分散法

所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號針)，使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

(二)消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀)，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。

 

消化分離法的操作步驟 

1)剪切把組織塊剪碎，呈 1~5mm3 大小的組織塊。

2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂 PBS 洗 2-3 次(采用傾斜，自然沉降法)。

3)消化 加入消化液 (胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA )于 37℃水浴中作用適當(dāng)時間 (中間可輕搖 1~2 次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。

4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入完全培養(yǎng)基。

6)機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或 3~4 層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降 5~10 分鐘，吸上層細(xì)胞懸液進行分瓶培養(yǎng)。

注意事項如下

1)組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

2)胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。

3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失

 

3. 酶消化法

1）無菌

確保使用無菌設(shè)備、試劑和技術(shù)收集和處理組織。使用個人防護設(shè)備以避免污染。使用0.22微米的膜無菌過濾所有酶和試劑。

2）切塊

用無菌剪刀或手術(shù)刀將組織標(biāo)本切成小塊(通常為2×4mm)，然后將小塊放入選定的緩沖液、培養(yǎng)基或鹽溶液中。

3）加酶

將組織清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入您選擇的酶如膠原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，約0.5 mg/ml～1.5mg/ml的酶。

4）孵育

將組織樣本在其最佳溫度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分鐘。定期混合或輕輕搖動標(biāo)本。

5）洗滌

通過輕輕移液來分散細(xì)胞(也稱為研磨)，然后，使用細(xì)網(wǎng)過濾細(xì)胞懸浮液。讓細(xì)胞沉淀并潷出多余的含液酶;洗兩到三次。含有FBS，BSA或其他抑制劑的洗滌溶液也可用于阻止酶消化。

6）分析

將細(xì)胞重懸于正確的培養(yǎng)基或緩沖液中，然后定量測定細(xì)胞產(chǎn)量和活力。這是細(xì)胞分離過程中的重要步驟，因此您可以評估解離技術(shù)的結(jié)果。大多數(shù)研究人員使用血細(xì)胞計數(shù)器測定細(xì)胞產(chǎn)量，并使用臺盼藍(lán)重氮染料測量細(xì)胞活力。

7）培養(yǎng)

根據(jù)所分離的細(xì)胞來選擇最適合研究的方案和處理步驟來培養(yǎng)細(xì)胞。

 

重點注意事項

①使用細(xì)胞分離酶時，請注意溫度和濕度條件。如蛋白水解酶可以自動分解，因此建議在使用前立即將其溶解，并在冰上保存2℃～8℃。

②通常用于細(xì)胞分離的大多數(shù)酶可以直接溶解于平衡鹽溶液或所選緩沖液中。對于許多細(xì)胞分離中，確保解離期間的組織存活，需要孵育培養(yǎng)基充分氧化并在生理pH下緩沖。95%O2、5%CO2平衡的介質(zhì)來完成。
 

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