大多數(shù)細(xì)胞分離程序之前都是盡可能多地去除無關(guān)材料，尤其是當(dāng)新鮮分離的組織是起始材料時。下面列舉了一些常見的過程。

實體組織的消化/分解——需要首先將整個組織的碎片分解成單細(xì)胞懸浮液。表 2 總結(jié)了常用方法，試劑盒可用， Miltenyi Biotec的神經(jīng)和腫瘤組織分離試劑盒。Thermo Fisher / Gibco 的膠原酶和 TrypLE 是受歡迎的選擇 。在消化/分解過程中可能會引入實驗偽影，例如，釋放酶會引入轉(zhuǎn)錄偽影 ，酶消化會激活小膠質(zhì)細(xì)胞。

從血液中分離血漿——血漿是血液中含有凝血因子、白蛋白、鹽、礦物質(zhì)等的液體部分，可能會干擾細(xì)胞檢測。因此，血沉棕黃層通常比全血更受歡迎：后者收集在涂有抗凝劑的試管中，然后以 200 xg 的速度離心并關(guān)閉剎車。將富含 WBC 的帶或夾在上血漿和下 RBC 層之間的血沉棕黃層仔細(xì)吸出。

去除死細(xì)胞和碎片——原代細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞通常需要“清理”死細(xì)胞和碎片，以確保下游步驟順利進(jìn)行。200-300 xg 的低速離心、重力沉降和尼龍網(wǎng)篩是實現(xiàn)這一目標(biāo)的一些簡單方法。也可以使用特定的試劑盒，例如死細(xì)胞去除試劑盒。
 

類型	例子	組織
機械均化	聲波處理、手動粉碎、高速混合	軟組織
酶消化	膠原酶、蛋白酶 K、嗜熱菌蛋白酶	軟組織和軟骨組織
酸消化	鹽酸	骨和纖維組織

基于細(xì)胞粘附的細(xì)胞分離技術(shù)

細(xì)胞的粘附特性
根據(jù)細(xì)胞是否需要附著在固體表面上才能生存和生長，可以分為以下幾類：
· 粘附 - 這些細(xì)胞需要合適的表面才能生長，例如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。這種附著是通過細(xì)胞表面上的細(xì)胞粘附分子 (CAM) 與培養(yǎng)物上的相應(yīng)配體之間的相互作用發(fā)生的表面。在體外細(xì)胞粘附方面重要的 CAM 家族是整合素家族，它可以附著在膠原蛋白、纖連蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上。
· 懸浮細(xì)胞——這些細(xì)胞自然不需要附著表面，而是懸浮在體內(nèi)，通常在血液和淋巴液等液體中。例子包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞。這些細(xì)胞的體外生長和選擇也發(fā)生在懸浮液中。胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞也不需要錨定，可以在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長。
· 失去接觸抑制和錨定依賴性的癌細(xì)胞。在沒有任何錨定設(shè)施的無血清條件下，癌細(xì)胞可以形成球體和無定形聚集體。

細(xì)胞培養(yǎng)容器的粘附特性
自從哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和診斷的主要內(nèi)容以來，培養(yǎng)容器的制造——特別是聚合物表面——也經(jīng)歷了重大改進(jìn)。直到 1950 年代，只有 Pyrex® 玻璃燒瓶和培養(yǎng)皿可用，這嚴(yán)重限制了原代細(xì)胞的培養(yǎng)范圍（因為后者不附著在玻璃表面），并且還產(chǎn)生了額外的維護(hù)和滅菌費用。第一個一次性塑料培養(yǎng)容器于 1960 年代問世，由聚苯乙烯制成，具有光學(xué)透明度、延展性和易于消毒的特性。然而，簡單的聚苯乙烯由于其疏水性而無法解決細(xì)胞不粘附的問題。該溶液用于處理聚苯乙烯表面，使其更具親水性。實現(xiàn)這一目標(biāo)的主要方法有以下三種：

· 氧化——成型后不久，聚苯乙烯表面用化學(xué)氧化劑或電離輻射處理，產(chǎn)生氧化離子并接枝到聚苯乙烯鏈中。這種處理使帶負(fù)電荷的血清蛋白結(jié)合的聚苯乙烯表面帶正電，由此產(chǎn)生的血清擴散為細(xì)胞附著提供了更好的表面。已經(jīng)測試了各種氧化劑，例如臭氧、、氫氧化鉀、鹽酸、紫外線輻射等。如今，采用的方法是在大氣壓下暴露于電暈放電或在真空下暴露于氣體等離子體。

· 蛋白質(zhì)涂層——氧化聚苯乙烯的局限性在于它只能支持細(xì)胞在含有血清的培養(yǎng)基中生長。為了支持需要無血清條件的貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)，需要一種可以附著在細(xì)胞上特定粘附受體上的蛋白質(zhì)涂層。用于涂層的常見細(xì)胞外基質(zhì)蛋白有膠原蛋白、纖連蛋白、軟骨素等 。

· 用聚賴氨酸包被——聚賴氨酸是一種陽離子聚合物，它為細(xì)胞膜的帶負(fù)電荷的離子提供一個帶正電荷的培養(yǎng)表面。使用聚賴氨酸的優(yōu)點是它與所有貼壁細(xì)胞類型非特異性相互作用，因此聚賴氨酸涂層板可用于不同的細(xì)胞類型和培養(yǎng)物 。

用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的說法，所有上述類型的板都被稱為“組織/細(xì)胞培養(yǎng)處理”。相反，一些細(xì)胞需要懸浮培養(yǎng)以進(jìn)行特殊培養(yǎng)，例如胚狀體或腫瘤球體的形成。超低附著板可用于此類應(yīng)用 - 這些表面涂有親水性凝膠，可中和任何表面電荷并防止細(xì)胞粘附并使它們保持懸浮。
 
通過粘附特性分離細(xì)胞
根據(jù)細(xì)胞的貼壁依賴性，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)大致分為貼壁式和懸浮式。通過添加必要的生長因子和合適的細(xì)胞培養(yǎng)板，可以根據(jù)特定的細(xì)胞類型對貼壁細(xì)胞和自由漂浮細(xì)胞的分離進(jìn)行調(diào)整。我們在下面描述三個例子：
· 貼壁培養(yǎng)——例如：巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞
巨噬細(xì)胞通常從骨髓或外周血中分離出來。分離單核細(xì)胞后，可以將它們與血清和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分化細(xì)胞因子混合物一起接種在包被的聚苯乙烯板上。5-7 天后，細(xì)胞分化并形成單層貼壁，而不需要的細(xì)胞仍處于懸浮狀態(tài)并被丟棄。小膠質(zhì)細(xì)胞、腦巨噬細(xì)胞也可以類似地分離出來 。
· 懸浮培養(yǎng)物——例如：干細(xì)胞、胚狀體、腫瘤球。
在沒有血清的情況下，通過在超低附著板中培養(yǎng)，可以將在懸浮液中自然生長的細(xì)胞和失去貼壁依賴性的細(xì)胞與貼壁細(xì)胞分離。所需的細(xì)胞要么在單細(xì)胞懸浮液中生長，要么聚集形成漂浮的球體。沒有附著表面的支持，貼壁細(xì)胞就會消失 。例如，Hoffmann M 等人通過去除粘附的成纖維細(xì)胞獲得了人氣道上皮細(xì)胞。

基于粘附的隔離的應(yīng)用、優(yōu)點和局限性
基于粘附的方法在技術(shù)上簡單、可重復(fù)且大多具有成本效益，可產(chǎn)生良好的細(xì)胞作物。限制是回收細(xì)胞的純度很低，并且總是存在與其他細(xì)胞以及細(xì)菌交叉污染的風(fēng)險。
具體應(yīng)用包括 ：
· 血液和骨髓細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞的常規(guī)分離。
· 癌癥干細(xì)胞（例如結(jié)腸球、乳腺球、神經(jīng)球）的分離和表征有助于識別和擴增稀有的癌癥干細(xì)胞。
· 從分化的譜系陽性細(xì)胞中分離成體干細(xì)胞和祖細(xì)胞。

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