一般來(lái)講，細(xì)胞轉(zhuǎn)移最有效的方法是進(jìn)行低溫保存（- 70℃～- 196℃），而細(xì)胞超低溫保存的基本原理是：當(dāng)細(xì)胞處于- 70℃ 以下環(huán)境時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故而可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過(guò) 0～- 20℃ 階段的程序降溫，在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

經(jīng)過(guò)研究人員的長(zhǎng)期試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇基本原則是慢凍速融，這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。
 

材料準(zhǔn)備

1、儀器：凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、- 20℃、- 70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、廢液缸。

3、塑料器皿：吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10 ml）、15 ml 離心管、凍存管（1～2 ml）。

4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5、PBS, 胎牛血清，DMSO，培養(yǎng)液，雙抗，胰蛋白酶（0.25%）。
 

細(xì)胞凍存

目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由冰晶形成的細(xì)胞損傷。

1、10% 的 DMSO+ 90% 胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細(xì)胞凍存。

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至 15 ml 離心管中。

3、離心 1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為 5x10^6 /ml～1x10^7 /ml。

5、 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者。

6、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾? 1～- 2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)到- 25℃ 以下時(shí)，可增至- 5℃～- 10℃/min；到- 100℃ 時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入- 20℃ 冰箱 2 h，然后放入- 70℃ 冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

細(xì)胞復(fù)蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入 37℃ 溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2、從 37℃ 水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加 10 倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3、離心，1000 rpm，5 min。

4、棄去上層清液，加入含 10% 胎牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃ 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
 

注意要點(diǎn)

1、冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好。

2、與液氮接觸的操作，注意戴保護(hù)眼鏡和手套。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，水浴中搖動(dòng)小瓶易爆炸。且 DMSO 為有毒致癌品，接觸時(shí)帶好手套。

3、凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠，一般最低要達(dá)到 5x10^6 /ml。濃度視情況而定。

4、做好標(biāo)記：培養(yǎng)瓶上應(yīng)該用馬克筆做好標(biāo)記，寫(xiě)上細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)和凍存時(shí)間。

5、對(duì)剛復(fù)蘇的細(xì)胞動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞破裂。

6、DMSO 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞不敏感，所以解凍之后不需要除去 DMSO，解凍后頻繁換液會(huì)慢慢除去 DMSO。部分對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞需要除去 DMSO。

7、解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清，突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良，甚至死亡。