介紹：

在全球范圍內，癌癥每年造成約 1000 萬人死亡。1與癌癥相關的死亡的主要原因不是原發(fā)腫瘤，而是癌癥轉移：惡性細胞侵入原發(fā)腫瘤以外的組織并在這些組織中擴散1，基礎癌癥研究是世界衛(wèi)生組織降低癌癥死亡率1戰(zhàn)略的關鍵因素之一，研究轉移的潛在機制可為主要臨床問題提供重要信息。

 

在癌癥轉移中，單細胞的遷移在很大程度上受化學線索的影響，化學線索通過趨化性2為細胞遷移提供方向：單細胞沿著化學引誘物的濃度梯度遷移。3已經描述了各種化學引誘物用于通常研究的細胞系。據(jù)報道，HeLa 細胞（宮頸癌細胞）向更高濃度的纖維連接蛋白4和基質細胞衍生因子 1α 遷移。5已描述大鼠神經膠質瘤細胞系 C6 被緩激肽吸引。6包含所有上述化學引誘劑分子的細胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)劑是胎牛血清 (FBS；未出生小牛的血清)。7-9因此，F(xiàn)BS 為化學線索提供了一個有趣且直接的模型系統(tǒng)提供給癌細胞。

 

然而，為了研究癌細胞對化學線索的反應，需要在具有化學引誘劑梯度的環(huán)境中進行準確的細胞追蹤。已經進行了多種細胞培養(yǎng)容器設計，向細胞10-12提供趨化梯度，對細胞成像和監(jiān)測。

 

這些血管中的細胞可以提供實際問題。目前，最常用的活細胞成像裝置是具有足夠放大倍數(shù)的顯微鏡和用于調節(jié)培養(yǎng)條件的臺面培養(yǎng)箱。雖然這些顯微鏡具有精確成像和細胞跟蹤所需的光學特性，但在使用這種設置進行活細胞成像時存在實際問題。與專用培養(yǎng)箱相比，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)條件的調節(jié)對變化更敏感。13,14此外，圖像僅在某些時間點捕獲，但顯微鏡無法用于其他用戶在此期間的（端點）成像整個實時成像實驗。可以克服這些問題的系統(tǒng)是 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒。這種用于活細胞成像的專用系統(tǒng)適用于常規(guī)培養(yǎng)箱，因此可以在恒定和最佳的培養(yǎng)環(huán)境中進行培養(yǎng)監(jiān)測。 這些設備的光學特性提供了高質量的成像，以及準確的細胞追蹤。通過將同一培養(yǎng)箱內的兩個設備連接到一臺筆記本電腦，可以同時監(jiān)測和比較兩種培養(yǎng)物，而無需為其他實驗室成員占用顯微鏡。

 

在這項概念驗證研究中，我們使用并排的高質量活細胞成像來確定 FBS 梯度對癌細胞系定向遷移的影響。使用ibidi µ-Slide Chemotaxis, CytoSMART® Lux3 BR Duo Kit 用于監(jiān)測暴露于 FBS 梯度或恒定 FBS 濃度的兩種癌細胞系。隨著時間的推移跟蹤細胞，這提供了對癌細胞趨化遷移的基本見解，這可能最終與癌癥轉移有關。
 

ibidi 80326

 

圖 1：實驗設置。將癌細胞系接種在 Ibidi µ-Slide Chemotaxis 中并添加培養(yǎng)基，從而產生 FBS 梯度或恒定 FBS 濃度。使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒監(jiān)測培養(yǎng)物 24 小時，成像間隔為 5 分鐘。

 

材料和方法：

在標準培養(yǎng)條件下，將 HeLa 細胞（Innoprot P20107）和 C6 細胞（ATCC CCL-107）在補充有 10% FBS (Gibco) 和 1% pen-strep (Gibco) 的 DMEM (Gibco) 中培養(yǎng)至亞融合 (37 °C；5% CO2)。每個癌細胞系以每通道 18,000 個細胞（6 µl 細胞懸浮液；300 萬個細胞/ml；含 10% FBS 的培養(yǎng)基）接種在 Ibidi µ-Slide Chemotaxis 中。將 65 µl 培養(yǎng)基（DMEM、FBS、pen-strep）添加到兩邊水庫中：一個水庫中的 20% FBS 和另一個水庫中的 0% FBS 或兩個水庫中的 10% FBS（圖 1）。使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒（37°C；5% CO2）制作培養(yǎng)物的高質量圖像：監(jiān)測培養(yǎng)物 24 小時，每 5 分鐘拍攝一次快照。然后，從 CytoSMART® Cloud 導出圖像，并使用 FIJI 插件 TrackMate 跟蹤單個細胞。15使用 FIJI 插件 Chemotaxis 和遷移工具將跟蹤的路徑轉換為趨化圖。16

結果：

圖 2（HeLa 細胞）和圖 3（C6 細胞）中顯示了具有 FBS 梯度或恒定 FBS 濃度的培養(yǎng)物的延時圖像。HeLa 細胞在恒定 FBS 濃度下從它們的起源遷移了更遠的距離，但表現(xiàn)出略微傾向于向更高的遷移暴露于梯度時的 FBS 濃度。在恒定的 FBS 濃度下，C6 細胞似乎從原點遷移的距離更小。然而，這些細胞在 FBS 梯度中也顯示出較少的定向遷移 - 因此沒有明顯的趨化遷移。

圖 2：HeLa 細胞在恒定 FBS 濃度下遷移更大的距離，但在暴露于梯度時更傾向于向更高的 FBS 濃度遷移。A) 使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo Kit 制作的 HeLa 細胞原始圖像，使用 FIJI 插件 TrackMate 進行單細胞檢測（紫色）和路徑檢測（黃色）。B) 使用 FIJI 插件趨化性和遷移工具可視化的 HeLa 細胞的趨化位移，縱向和橫向位移相對于 FBS 梯度定義。

 

 

圖 3：C6 細胞在 FBS 梯度中沒有顯示出明顯的趨化遷移。A) 使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒制作的 C6 細胞原始圖像，使用 FIJI 插件 TrackMate 進行單細胞檢測（紫色）和路徑檢測（黃色）。B) 使用 FIJI 插件趨化性和遷移工具可視化的 C6 細胞的趨化位移，縱向和橫向位移相對于 FBS 梯度定義。

 

討論：

癌癥轉移是癌癥相關死亡的主要原因，因此細胞遷移是癌癥研究的重要課題。高質量的活細胞成像是準確細胞追蹤的先決條件，它提供了對驅動轉移性細胞遷移機制的基本見解。這些機制之一是趨化性，其中細胞沿著趨化劑的梯度增加遷移。本研究旨在通過 ibidi µ-Slide Chemotaxis和CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒使用并排高質量活細胞成像來確定 FBS 梯度對癌細胞系定向遷移的影響。這些設備提供了可立即應用于分析軟件的高質量圖像，從而實現(xiàn)輕松準確的單細胞跟蹤。從該跟蹤中可以看出，HeLa 細胞更傾向于向更高的 FBS 濃度遷移，而 C6 細胞則不太清楚。

 

宮頸癌是最常見的轉移性原發(fā)腫瘤之一，轉移灶見于例如骨、肝和肺組織。17膠質瘤轉移是一種非常罕見的現(xiàn)象。18,19這些轉移中的每一個的臨床患病率都可能與血清的多少有關 - 在本研究中由 FBS 建模– 作為細胞的化學引誘劑。由于通過血流擴散是轉移17的主要機制，因此腫瘤細胞向血管的定向遷移和可能的趨化遷移可引發(fā)轉移。與神經膠質瘤細胞系 C6 相比，在本研究中顯示出更多趨化遷移的宮頸癌細胞系 HeLa 似乎與相應轉移的臨床患病率一致。

 

在本研究中用作化學引誘劑的 FBS 提供了一個實驗上簡單的模型系統(tǒng)。除此之外，這種設置模擬了向血管的定向遷移。然而，F(xiàn)BS 具有可變且復雜的組成 20，因此對負責所研究細胞定向遷移的特定分子幾乎沒有提供任何了解。還應考慮到 FBS 具有除趨化遷移外影響細胞行為的其他特性：例如，細胞培養(yǎng)物中的 FBS 濃度會影響細胞增殖。21盡管在高 FBS 濃度和低 FBS 濃度下增殖率沒有明顯差異觀察到，細胞遷移可能仍然受到其他 FBS 相關過程的影響。因此，在相同設置下的后續(xù)實驗，使用單個化學引誘劑可以提供有關細胞行為的更詳細信息。

 

結論：

在這項研究中，我們成功地展示了使用高質量活細胞成像進行準確細胞追蹤的可能性。 ibidi µ-Slide Chemotaxis，CytoSMART® Lux3 BR Duo Kit 能夠并行監(jiān)測實驗條件，并提供直接適用于細胞追蹤的圖像。這揭示了趨化性。

HeLa 細胞在 FBS 梯度中的遷移，而 C6 細胞沒有顯示出明顯的趨化遷移。高質量的成像和相應的結果最終可能與癌癥轉移的基礎研究相關。

 

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