本應(yīng)用說明討論了對于細(xì)胞粘附到 ibidi µ-Patterns 的重要實驗參數(shù)。此外，它還解釋了如何優(yōu)化細(xì)胞粘附和模式覆蓋。

關(guān)鍵詞

· µ-Patterning、粘附、結(jié)合基序、單細(xì)胞模式、多細(xì)胞微模式、細(xì)胞培養(yǎng)、粘附細(xì)胞

細(xì)胞類型

ibidi µ-Patterning 的成功實驗僅限于貼壁細(xì)胞類型——懸浮細(xì)胞不能附著在圖案表面。此外，對 µ-Pattern 表面的粘附高度依賴于細(xì)胞類型，因為并非所有細(xì)胞類型都與所有結(jié)合基序結(jié)合。因此，在開始實驗之前，有必要測試所選細(xì)胞類型是否能夠粘附在圖案表面上。

 

結(jié)合基序

ibidi µ-Patterning 技術(shù)為細(xì)胞粘附提供共價結(jié)合的結(jié)合基序。這些結(jié)合基序的表面密度可能不同于經(jīng)典的蛋白質(zhì)涂層。因此，結(jié)合基序可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)或粘附行為的改變。測試您的細(xì)胞是否與結(jié)合基序兼容的最佳方法是將它們接種在具有大粘合面積的圖案點上（例如，多細(xì)胞圖案）。驗證單元格兼容性后，您可以切換到更小的模式，例如單單元格模式。

 

幾何圖案

由于結(jié)合基序的數(shù)量，圖案幾何形狀會影響細(xì)胞的粘附行為。例如，較小的形狀呈現(xiàn)較少的結(jié)合基序，與較大的形狀相比，這可能會降低細(xì)胞粘附。特別是對于單細(xì)胞實驗，需要在圖案上實現(xiàn)單細(xì)胞占有率，圖案尺寸非常重要，因為太小的圖案阻礙了適當(dāng)?shù)募?xì)胞粘附和擴(kuò)散，而太大的圖案會導(dǎo)致多個細(xì)胞粘附在一個單點。此外，當(dāng)所用細(xì)胞類型的間距太小時，粘附斑塊之間的間距會影響理想的細(xì)胞接種濃度和細(xì)胞從一個點到另一個點的橋接。

細(xì)胞接種濃度

接種濃度是優(yōu)化粘附過程的另一個關(guān)鍵參數(shù)。較低的濃度會導(dǎo)致圖案上的細(xì)胞較少，或者只有稀疏占據(jù)的斑點，但結(jié)塊較少。較高的細(xì)胞濃度可以提高細(xì)胞覆蓋率，但要承擔(dān) a) 結(jié)塊和 b) 在單細(xì)胞粘附位點上出現(xiàn)多個細(xì)胞的風(fēng)險。如果細(xì)胞濃度太高并且細(xì)胞在附著到粘附點之前開始聚集，這些漂浮的聚集體可能會從模式中分離粘附細(xì)胞并阻止進(jìn)一步的細(xì)胞粘附。

 

細(xì)胞懸液質(zhì)量

細(xì)胞懸液的均勻性高度影響實驗輸出。沒有任何細(xì)胞聚集體的單細(xì)胞懸浮液非常適合單細(xì)胞檢測。接種細(xì)胞簇或球體懸浮液是 3D多細(xì)胞檢測的一種選擇。

 

培養(yǎng)時間

接種細(xì)胞后的孵育時間會影響粘附過程。與其他表面相比，細(xì)胞附著在圖案上所需的時間可能不同。在粘合過程中移動 µ-Patterned 載玻片時要特別小心。未連接或僅松散連接的細(xì)胞可能會開始結(jié)塊。

 

機(jī)械應(yīng)力和洗滌

部分附著的細(xì)胞可能會被機(jī)械力沖走。利用這種效果有助于去除細(xì)胞或碎片。根據(jù)洗滌步驟的強(qiáng)度（剪切應(yīng)力），可能會從表面洗掉更多或更少的細(xì)胞。

 

細(xì)胞適合度

細(xì)胞的活力和適應(yīng)性是適當(dāng)細(xì)胞粘附的重要因素。因此，請確保優(yōu)化細(xì)胞制備過程，以最大限度地減少細(xì)胞壓力。優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化影響細(xì)胞健康的因素，例如化學(xué)分離、溫度、機(jī)械應(yīng)力、懸浮時間、培養(yǎng)基成分和其他細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。

優(yōu)化 µ-Pattern 上的細(xì)胞粘附

 

 

初步測試：細(xì)胞類型是否與 µ-Pattern 兼容？

 

如果您不知道您的細(xì)胞類型是否與 µ-Patterning 的結(jié)合基序兼容，我們建議首先在多細(xì)胞 µ-Pattern 上運行初始細(xì)胞粘附測試。在較大圖案上測試粘附減少了對結(jié)合基序本身的初始兼容性測試，同時排除了單細(xì)胞和圖案幾何效應(yīng)。

· 按照說明中的協(xié)議使用 2-3 種不同的細(xì)胞接種濃度，并通過將它們孵育至少 4 小時直至過夜，讓細(xì)胞不受干擾地粘附。

· 在洗掉未附著的細(xì)胞之前, 用相差顯微鏡控制細(xì)胞附著。拍攝細(xì)胞圖像總是有助于隨后優(yōu)化過程。

· 洗滌后至少 2 小時拍攝額外的圖像，讓細(xì)胞有時間從洗滌時經(jīng)歷的剪切應(yīng)力中恢復(fù)。

請注意：在此階段，不需要最佳模式覆蓋。任何細(xì)胞都堅持該模式是很重要的。如果是這種情況，您可以繼續(xù)優(yōu)化所需模式的播種參數(shù)。如果您在孵育過夜后仍未在圖案上看到任何細(xì)胞附著，則您的細(xì)胞類型可能與所使用的結(jié)合基序不兼容。

優(yōu)化附著在 µ-Pattern 上的細(xì)胞的播種參數(shù)

 

如果您知道細(xì)胞與 µ-Pattern 的結(jié)合基序結(jié)合，則可以開始優(yōu)化所需模式上的細(xì)胞接種參數(shù)。請考慮每個模式都需要針對您的特定細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化，因為模式大小和模式之間的距離在很大程度上影響播種參數(shù)。確保細(xì)胞至關(guān)重要，并且您有單細(xì)胞懸液。

 

第一次優(yōu)化運行

· 按照說明在載玻片上接種至少三種不同濃度的細(xì)胞。

· 讓細(xì)胞在洗滌前無干擾地粘附至少 4 小時。

· 在洗滌前和洗滌后至少 2 小時拍攝細(xì)胞圖像。

 

可能的結(jié)果和故障排除

 

– 洗滌后，細(xì)胞很好地固定在圖案上，圖案覆蓋度很好。

您已經(jīng)為您的實驗找到了合適的播種參數(shù)。您可以使用相同的條件開始您的實驗。

 

– 洗滌前，只有少數(shù)細(xì)胞漂浮和聚集。洗滌后，圖案上的細(xì)胞很少，圖案覆蓋率差。

細(xì)胞密度可能太低。在洗去未附著的細(xì)胞之前，嘗試更高的接種濃度并考慮更長的孵育時間。

 

– 在洗滌之前，有很多漂浮的、聚集的細(xì)胞。洗滌后，圖案上的細(xì)胞很少，圖案覆蓋率差。

細(xì)胞密度可能太高。嘗試降低初始接種濃度，因為過高的細(xì)胞密度通常會導(dǎo)致細(xì)胞聚集，阻礙細(xì)胞與模式結(jié)合。此外，在播種后 2 小時和 3 小時檢查細(xì)胞，看看更短的孵化時間是否會導(dǎo)致更少的聚集，從而更好地覆蓋模式。

 

– 洗滌后，圖案上會出現(xiàn)不需要的細(xì)胞聚集。

這表明初始接種濃度太高/或洗滌前孵育時間太長。嘗試較低的接種濃度，并在 2 小時和 3 小時后檢查細(xì)胞，看看較短的孵育時間是否足以使細(xì)胞粘附良好。

 

– 當(dāng)使用小的單細(xì)胞斑點或細(xì)線時，圖案上沒有細(xì)胞粘附或細(xì)胞呈圓形且不會擴(kuò)散。

如果您從之前的實驗中知道細(xì)胞可以與所使用的圖案結(jié)合基序結(jié)合，則圖案尺寸對于您的細(xì)胞類型來說可能太小，并且細(xì)胞沒有足夠的空間來正確傳播和粘附。因此，為您的實驗使用更大的圖案尺寸。

 

第二次優(yōu)化運行

· 如上所述，根據(jù)第一次優(yōu)化運行的結(jié)果使用優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。

將您的結(jié)果與第一次優(yōu)化運行進(jìn)行比較，如有必要，進(jìn)入另一輪優(yōu)化。

示例圖像

圖1，L929 細(xì)胞不同接種濃度對單個細(xì)胞模式的影響。(A) 將細(xì)胞以 1*10 5cells/ml加入µ-Slide VI 0.4，(B) 3*10 5 cells/ml、(C) ) 5.25*105 cells/ml。24 小時后，洗去未附著的細(xì)胞，并在洗滌后 2 小時拍攝圖像。在低接種密度下，許多點沒有被任何細(xì)胞覆蓋。然而，在太高的接種濃度下，細(xì)胞開始在圖案上聚集。

 

 

圖 2：不同圖案孔大小對 Rat1 細(xì)胞在單個細(xì)胞圖案上的傳播行為的影響。將細(xì)胞接種到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 為 (A) 20 µm 正方形，距離為 110 µm 或 (B) 30 µm 正方形，距離為 110 µm，濃度為 9*105 cells/ml。24 小時后，洗去未附著的細(xì)胞，并在洗滌后 2 小時拍攝圖像。對于 Rat1 細(xì)胞，20 µm 正方形對于良好的細(xì)胞擴(kuò)散來說太小了，而 30 µm 正方形為細(xì)胞提供了足夠的區(qū)域以在圖案上展平。

 

圖 3：不同圖案幾何形狀對 NIH3T3 細(xì)胞在單個細(xì)胞圖案上的擴(kuò)散行為的影響。將細(xì)胞接種到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 為 (A) 20 µm 正方形，距離為 110 µm，或 (B) 30 µm 正方形，距離為 110 µm，濃度為 3* 10 5 cells/ml。24 小時后，洗去未附著的細(xì)胞，并在洗滌后 2 小時拍攝圖像。對于 NIH3T3 細(xì)胞，20 µm 正方形對于良好的細(xì)胞擴(kuò)散來說太小了，而 30 µm 正方形為細(xì)胞提供了足夠的區(qū)域以使其在圖案上變平。然而，由于圖案邊緣之間的距離小了 10 µm，細(xì)胞能夠從一個點連接到另一個點。對于該細(xì)胞系，需要更大的圖案之間的距離。

 

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