本應(yīng)用實(shí)驗(yàn)是在µ-Slide球體灌注載玻片中創(chuàng)建多細(xì)胞球體示例。從鼠成纖維細(xì)胞系L929的懸浮液形成球狀體后，用ibidi Pump System灌注。這樣可以確保長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中球體的最佳營養(yǎng)。
 

材料：

· μ-Slide球體灌注生物惰性載玻片（80350，ibidi，德國）

· 鼠成纖維細(xì)胞L929系（ACC 2，DSMZ，德國）

· 細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI-1640（21875034）與FCS（10270106），Gibco）

· 切割酶（A1110501，Gibco）

· ibidi泵系統(tǒng)（10902，ibidi，德國）

· 藍(lán)色灌注套件，15厘米，內(nèi)徑0.8毫米（10961，ibidi，德國）

· 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（無菌工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶，PBS等）

 

重要說明：在37°C和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，平衡所有必需的材料，如µ-Slides，培養(yǎng)基和管道（灌注套件）。這對(duì)于防止氣泡隨時(shí)間流逝至關(guān)重要。

 

1. 細(xì)胞制備和接種

· 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)L929細(xì)胞。

· 用Accutase處理細(xì)胞1-2分鐘以使其脫離。

· 收獲細(xì)胞懸液。

· 離心細(xì)胞懸液并在培養(yǎng)基中稀釋；該量取決于所需的細(xì)胞濃度。

· 計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整至5 x 105細(xì)胞/ ml的濃度。

· 根據(jù)說明準(zhǔn)備µ-Slide。

· 將細(xì)胞接種到µ-Slide的通道中。不要忘記為靜態(tài)控制接種細(xì)胞。

· 在37°C和5％CO2下孵育過夜以形成球狀體。

 

2. 球狀體形成

 

· 在相襯顯微鏡下觀察球狀體的形成。

· 可選：形成球狀體后，用新鮮培養(yǎng)基洗滌1次。

在開始灌注之前，在37°C和5％CO2中孵育一小時(shí)

3. 灌注實(shí)驗(yàn)

 

· 根據(jù)說明準(zhǔn)備用于流動(dòng)連接的µ-Slide，ibidi泵系統(tǒng)和灌注套件。

· 要清除系統(tǒng)中的氣泡，請(qǐng)?jiān)谶B接µ-Slide之前使其運(yùn)行1-2小時(shí)。

· 將µ-Slide連接到管路和泵系統(tǒng)。

· 以5 mbar開始灌注實(shí)驗(yàn)，流速為0.75 ml / min。

· 確定流速。如有必要，請(qǐng)調(diào)節(jié)壓力以創(chuàng)建所需的流速。

· 對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)，請(qǐng)按照µ-Slide球體灌注的說明每?jī)商爝M(jìn)行一次培養(yǎng)基更換。

 

 

4. 結(jié)果

接種后立即開始形成球體。在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，施加流量會(huì)導(dǎo)致球體更強(qiáng)的增殖，由于最佳營養(yǎng)，導(dǎo)致球體直徑增加。

 

 

L929成纖維細(xì)胞在µ-Slide球狀體灌流中顯示球狀體形成，Bioinert，第1-14天，接種濃度為5 x 105單細(xì)胞/ ml。上部圖：用ibidi Pump System灌注，0.75毫升/分鐘。下部圖：無灌注，第二天換培養(yǎng)基。相襯顯微鏡，10倍物鏡，孔直徑800 µm。
 

在μ-Slide球狀體灌流，生物惰性，接種濃度5 x 105單細(xì)胞/ ml中比較L929成纖維細(xì)胞的球狀體形成。靜態(tài)：無灌注，第二天換培養(yǎng)基。灌注：使用ibidi Pump System灌注，0.75毫升/分鐘。

 

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