細(xì)胞遷移在許多復(fù)雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測(cè)定是研究體外細(xì)胞遷移的簡(jiǎn)單方法。該測(cè)定基于以下觀察：當(dāng)在匯合細(xì)胞單層上產(chǎn)生人工間隙時(shí)，所產(chǎn)生的間隙邊緣上的細(xì)胞將遷移直至建立新的細(xì)胞。ibidi Culture-Insert 系列為傷口愈合實(shí)驗(yàn)提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個(gè)步驟。

本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)是使用 ibidiCulture-Insert 2 Well 分析 MCF-7 細(xì)胞遷移行為的詳細(xì)方案。

圖 1   使用 ibidi Culture-Insert 2 Well 進(jìn)行傷口愈合測(cè)定的實(shí)驗(yàn)工作流程

ibidi Culture-Insert 2 Well 放置在細(xì)胞培養(yǎng)表面上，提供兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器，每個(gè)容器由 500μm 壁隔開。在兩個(gè)儲(chǔ)庫(kù)中填充細(xì)胞懸浮液僅允許細(xì)胞在指定區(qū)域生長(zhǎng)。移除培養(yǎng)插入物 2 在適當(dāng)?shù)募?xì)胞附著后，產(chǎn)生大約 500μm 的無細(xì)胞間隙。顯微鏡用于評(píng)估傷口愈合過程。根據(jù)您感興趣的焦點(diǎn)，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時(shí)間點(diǎn)觀察圖像來完成。測(cè)量細(xì)胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細(xì)胞遷移特征。

實(shí)驗(yàn)工作流程也可以應(yīng)用于 Culture-Insert 3 Well 和 Culture-Insert 4 Well。他們的區(qū)別是更多的孔和相應(yīng)的更高數(shù)量的無細(xì)胞間隙。

• 細(xì)胞：                              MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ:ACC115)
• 同一實(shí)驗(yàn)軟件:                   2 孔插件放在 35 毫米的培養(yǎng)皿中，高壁（ibidi，        80206）
• 細(xì)胞培養(yǎng)表面：                 ibidi ibitreat
• 細(xì)胞培養(yǎng)基：                    RPMI (西格瑪，R8758) = 10% FCS (西格瑪,  F0804)
• 細(xì)胞解離溶液：                 胰蛋白酶-ETDA（Sigma，59418C）
• 無菌鑷子
• 倒置顯微鏡，最好具有自動(dòng)圖像采集系統(tǒng)和用于活細(xì)胞成像的階段頂部培養(yǎng)箱

實(shí)驗(yàn)工作流程
步驟 1：細(xì)胞接種

為了建立可靠的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，您必須在開始實(shí)驗(yàn)之前定義實(shí)驗(yàn)參數(shù)。這包括例如選擇正確的細(xì)胞接種密度。我們建議使用 24 小時(shí)后產(chǎn)生 100％ 光學(xué)匯合細(xì)胞層的密度。

1. 像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)至合適細(xì)胞濃度。在 24 小時(shí)后獲得 3×105 細(xì)胞/ ml以獲得匯合的細(xì)胞層。

2. 將 70μl 細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于 Culture-Insert2 孔的每個(gè)孔中。避免搖動(dòng) μ-Dish，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

3. 將細(xì)胞在 37°C 和 5％CO2 下孵育至少 24 小時(shí)

圖 2   在 ibidi Culture-Insert 2 Well 中接種細(xì)胞

匯合細(xì)胞層是開始該測(cè)定的先決條件。去除 Culture-Insert 2 孔后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要，補(bǔ)充培養(yǎng)基中的抑制或增強(qiáng)物質(zhì)，以評(píng)估其對(duì)細(xì)胞遷移行為的影響。

1. 在顯微鏡下 24 小時(shí)后檢查細(xì)胞密度。如果在 24 小時(shí)后沒有達(dá)到匯合的細(xì)胞層，則將 μ-Dish 再次置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中 12-24 小時(shí)，定期檢查匯合點(diǎn)。

2. 用無菌鑷子輕輕取出 Culture-Insert 2 孔。如圖 3 所示，刪除 Insert 一角

圖 3   使用無菌鑷子去除 ibidi Culture-Insert 2 孔

3. 移除插入后，檢查您的細(xì)胞層是否仍附著在 μ-Dish 的表面上。

4. 用無細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 清洗細(xì)胞層，去除細(xì)胞碎片和非附著細(xì)胞。

5. 使用推薦體積為 2 ml 的無細(xì)胞培養(yǎng)基填充 μ-Dish

圖 4   由 ibidi Culture-Insert 2 Well 創(chuàng)建的無細(xì)胞間隙

第 3 步：獲取顯微鏡圖片

我們建議錄制延時(shí)視頻，以確定時(shí)間依賴性和細(xì)胞遷移的特征。

1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動(dòng)它直到你有間隙，并在圖像中捕獲兩個(gè)細(xì)胞前端。使用 4x / 5x 或 10x 物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

2. 在接下來的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程。

3. 在 ibiTreat 表面上培養(yǎng)的 MCF-7 細(xì)胞的時(shí)間推移測(cè)量進(jìn)行 20 小時(shí)，時(shí)間間隔為 30 分鐘。

圖 5   使用 MCF-7 細(xì)胞的遷移測(cè)定的時(shí)間流逝測(cè)量（比例尺：200μm）

必須分析顯微照片以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動(dòng)完成，也可以使用自動(dòng)圖像分析完成自動(dòng)細(xì)胞分析系統(tǒng)（ACAS）由 ibidi 提供。

使用 ACAS 分析此處顯示的示例數(shù)據(jù)。自動(dòng)圖像分析檢測(cè)細(xì)胞覆蓋區(qū)域。相對(duì)于時(shí)間繪制細(xì)胞覆蓋區(qū)域顯示了間隙閉合的過程。線性相可用于表征遷移（=傷口閉合的速度）。

線性相的斜率顯示平均刮擦閉合速度為 0.0184×106μm2/ 小時(shí)（= 0.44×106μm2/ 天）。

圖 6   ACAS 傷口愈合實(shí)驗(yàn)的定量圖像分析