RRBS等揭示IDH1-R132H突變通過(guò)DNA甲基化加劇順鉑誘導(dǎo)腎毒性

瀏覽次數(shù)：91　發(fā)布日期：2025-1-6　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

順鉑（cisplatin）是一種廣泛使用的化療藥物，但其使用常伴隨著包括腎毒性在內(nèi)的多種副作用。急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）是與順鉑治療相關(guān)的最常見(jiàn)不良反應(yīng)之一,約30%患者因順鉑的腎毒性而中斷治療。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）的亞型IDH1在維持細(xì)胞氧化狀態(tài)的氧化還原平衡中起著重要作用，IDH1-R132H突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但順鉑是否會(huì)在攜帶IDH1-R132H突變的個(gè)體中引起更嚴(yán)重的腎毒性尚不清楚。深入探究順鉑誘導(dǎo)的腎毒性機(jī)制，并研究IDH1-R132H突變是否通過(guò)影響線粒體氧化應(yīng)激加劇順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷，從而促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷（Cis-AKI）發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要。

近日，福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科賴?yán)っ啦┦康葹榈谝蛔髡撸＝ㄡt(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科許艷芳教授和中國(guó)香港科學(xué)園腫瘤學(xué)及免疫學(xué)中心Tak W. Mak為共同通訊，在Nature子刊《Cell Death & Differentiation》(中科院1區(qū)top)發(fā)表了題為“The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction”的合作研究成果，研究通過(guò)RRBS等分析揭示了IDH1-R132H突變通過(guò)破壞NDUFA1和FSP1相互作用促進(jìn)鐵死亡，從而加重順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷，詳細(xì)探討了IDH1-R132H突變?cè)陧樸K化療中對(duì)腎臟毒性的影響，并揭示了其潛在的分子機(jī)制。

標(biāo)題：The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction（IDH1-R132H 突變通過(guò)破壞 NDUFA1 和 FSP1 互作促進(jìn)鐵死亡，從而加劇順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷）
發(fā)表時(shí)間：2024年9月22日
發(fā)表期刊：Cell Death & Differentiation
影響因子：IF 13.7/1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：RRBS、RNA-seq（易基因金牌技術(shù)）

本研究結(jié)果揭示IDH1-R132H突變加劇了腎小管中線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化和功能障礙，使腎臟更容易受到順鉑誘導(dǎo)的鐵死亡影響。IDH1-R132H突變?cè)黾覰dufa1啟動(dòng)子甲基化，從而抑制NDUFA1的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這種抑制破壞了NDUFA1與FSP1的相互作用，降低了其對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡的抵抗力。進(jìn)而導(dǎo)致活性氧（ROS）積累、脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生，促進(jìn)鐵死亡，從而引發(fā)急性腎損傷。總之，這項(xiàng)研究闡明了順鉑誘導(dǎo)的腎毒性新機(jī)制，并為攜帶IDH1-R132H突變的腫瘤患者個(gè)性化治療策略發(fā)展提供了寶貴見(jiàn)解。

研究方法
1.      動(dòng)物模型建立：使用特異性突變的IDH1在腎小管中（Idh1^WT/WTKsp^Cre）的小鼠模型，與Idh1^WT/WTKsp^Cre組進(jìn)行比較，通過(guò)腹腔注射順鉑建立Cis-AKI模型。
2.      細(xì)胞活性和細(xì)胞死亡評(píng)估：評(píng)估順鉑處理后腎小管上皮細(xì)胞（PTCs）的活性和死亡。
3.      氧化應(yīng)激和線粒體ROS的測(cè)量：使用DCFH-DA和MitoSOX等熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體ROS。
4.      脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體形態(tài)和線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)：評(píng)估順鉑處理后腎臟組織的脂質(zhì)過(guò)氧化水平和線粒體功能。
5.      免疫共沉淀和鄰位連接（PLA）實(shí)驗(yàn)：分析NDUFA1和FSP1之間的直接相互作用。
6.      CRISPR-Cas9技術(shù)：敲除Ndufa1和Fsp1基因以研究其在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。
7.      簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（RRBS）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）：用于分析IDH1-R132H突變對(duì)腎臟DNA甲基化模式和基因表達(dá)的影響。

結(jié)果圖形
（1）腎小管中的IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導(dǎo)的腎功能障礙

圖1：IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導(dǎo)的小鼠腎功能不全。

A-B. 檢測(cè)順鉑給藥后0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的血尿素氮（BUN）（A）和血清肌酐（Scr）水平（B）。結(jié)果顯示Idh1^WT/MutKsp^Cre小鼠的Scr和BUN水平高于Idh1^WT/WTKsp^Cre組。
C-F. 在腹腔注射10 mg/kg順鉑前1天和2小時(shí)預(yù)先使用鐵死亡抑制劑Lip-1進(jìn)行預(yù)處理。觀察0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)BUN和肌酐水平的變化。
G-H. 腹腔注射10 mg/kg順鉑3天后的PAS染色腎臟切片代表性圖像，H對(duì)G腎臟損傷結(jié)果定量分析。

（2）IDH1-R132H 突變加重順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和近端腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡

圖2：IDH1-R132H突變加劇順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡。

A-B. 對(duì)腎臟中TUNEL的定量分析和代表性染色圖像。Idh1^WT/MutKsp^Cre組中TUNEL陽(yáng)性的腎小管上皮細(xì)胞（proximal tubular epithelial cells，PTCs）數(shù)量高于Idh1^WT/WTKsp^Cre組。
C-D. 對(duì)腹腔注射10 mg/kg順鉑3天的腎臟進(jìn)行4HNE（紅色）和DAPI（藍(lán)色）的免疫熒光染色，隨后對(duì)4HNE陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行定量分析。
E. 在腹腔注射10 mg/kg順鉑3天后對(duì)腎臟中丙二醛（MDA）含量進(jìn)行定量分析。
F. 從腎臟中提取新鮮的近曲小管進(jìn)行western blot分析，重點(diǎn)關(guān)注鐵死亡和抗氧化信號(hào)分子表達(dá)。

（3）IDH1-R132H 突變通過(guò)促進(jìn)線粒體功能障礙誘導(dǎo)鐵死亡

圖3：IDH1-R132H突變通過(guò)促進(jìn)線粒體功能障礙來(lái)誘導(dǎo)鐵死亡。

A. 腎小管上皮細(xì)胞（TECs，細(xì)胞系）被感染帶有Flag-IDH1-WT和Flag-IDH1-R132H編碼的慢病毒36小時(shí)，隨后用25μm順鉑刺激24小時(shí)。感染后36小時(shí)進(jìn)行western blot檢測(cè)IDH1表達(dá)。
B-C. 將（A）中的TECs接種在12孔培養(yǎng)板中。接種后第10天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)分析。使用CCK-8實(shí)驗(yàn)（C）測(cè)量細(xì)胞增殖。
D–I. 從Idh1^WT/WTKsp^Cre組和Idh1^WT/MutKsp^Cre小鼠中分離出PTCs進(jìn)行分析。（D）代表性的PI染色圖像顯示順鉑誘導(dǎo)的PTCs細(xì)胞死亡。（E）使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細(xì)胞死亡。（F）在順鉑處理24小時(shí)后， Mitotracker和MitoSOX探針對(duì)細(xì)胞染色。（G）使用DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測(cè)順鉑誘導(dǎo)的Idh1^WT/WT和Idh1^WT/Mut PTCs的ROS產(chǎn)生，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。（H）使用JC-10染色方法測(cè)量順鉑處理后Idh1^WT/WT和Idh1^WT/Mut細(xì)胞的線粒體膜電位（MMP）。結(jié)果表明IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導(dǎo)的PTCs MMP的降低。（I）定量分析紅色聚集體與綠色單體比例。

（4）IDH1-R132H突變通過(guò)上調(diào)Ndufa1啟動(dòng)子甲基化水平抑制Ndufa1表達(dá)
IDH1-R132H突變主要通過(guò)改變表觀遺傳調(diào)控機(jī)制來(lái)影響細(xì)胞功能。作者假設(shè)腎小管中的IDH1-R132H突變可能會(huì)改變與線粒體相關(guān)基因的甲基化模式，從而加劇順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷。RRBS測(cè)序分析結(jié)果揭示在Idh1^WT/MutKsp^Cre小鼠腎臟的外顯子區(qū)域有15296個(gè)上調(diào)和7947個(gè)下調(diào)的差異甲基化基因，而在啟動(dòng)子區(qū)域觀察到12935個(gè)上調(diào)和4409個(gè)下調(diào)的差異甲基化基因（以Idh1^WT/WTKsp^Cre小鼠作為對(duì)照組）（附圖）�；蚋患治霰砻鲉�(dòng)子區(qū)域與組蛋白乙�；⒓�(xì)胞代謝和氧化磷酸化相關(guān)的信號(hào)被激活（圖4A）。在上調(diào)的甲基化位點(diǎn)中，與線粒體呼吸鏈組裝相關(guān)基因Ndufa1的啟動(dòng)子區(qū)域觀察到顯著增強(qiáng)的甲基化。進(jìn)一步的亞硫酸鹽測(cè)序PCR（BSP）結(jié)果與RRBS測(cè)序一致。Ndufa1啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域位于chrX:37191032-37191910區(qū)域，包含74個(gè)CpG位點(diǎn)。在體外實(shí)驗(yàn)中，Idh1^WT/WT組中Ndufa1區(qū)域的CpG位點(diǎn)約有47.4%被甲基化，而在Idh1^WT/Mut組中，約有82.4%的CpG位點(diǎn)被甲基化（圖4B）。在Idh1^WT/WTKsp^Cre小鼠的腎臟組織中，Ndufa1區(qū)域約有54%的CpG位點(diǎn)甲基化，而在Idh1^WT/MutKsp^Cre組中，約有80%的CpG位點(diǎn)甲基化。腎臟組織和體外PTCs的QT-PCR和western blot分析表明NDUFA1的表達(dá)水平降低（圖4C、D）。為了測(cè)試CpG甲基化是否在Ndufa1基因轉(zhuǎn)錄抑制中起直接作用，作者進(jìn)行了MSssI的補(bǔ)丁甲基化實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合熒光素酶活性檢測(cè)。分析結(jié)果表明CpG甲基化抑制了Ndufa1基因啟動(dòng)子活性，并在沉默Ndufa1中起直接作用。CpG位點(diǎn)甲基化由IDH1-R132H調(diào)控。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了由于IDH1-R132H突變引起的甲基化水平上調(diào)，導(dǎo)致Ndufa1的轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制。

附圖：RBBS質(zhì)控。

A. RBBS測(cè)序的六個(gè)樣本甲基化水平分布特征，不同樣本中CG、CHG和CHH甲基化位點(diǎn)一致分布。
B-C. Idh1^WT/WT和Idh1^WT/Mut組在CpG島和DNA啟動(dòng)子區(qū)域的CG、CHG和CHH的甲基化率。mCG、mCHG和mCHH分別代表CG、CHG和CHH的甲基化形式。
D-E. 基因元件和染色體上差異甲基化位點(diǎn)分布。
F-G. 基因元件甲基化水平分布。
CGI：CpG島。downshelf：CpG島上游2-4kb。downshore：CpG島上游2kb。upshelf：CpG島上游2-4kb。upshore：CpG島上游2kb。up2k：基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2kb。genebody：基因體區(qū)域。down2k：基因下游2Kb。

圖4：IDH1-R132H突變顯著增強(qiáng)了Ndufa1啟動(dòng)子的甲基化修飾水平。

A. RRBS測(cè)序?qū)Σ町惿险{(diào)啟動(dòng)子區(qū)域基因進(jìn)行GO富集分析，展示最顯著GO富集的生物學(xué)過(guò)程。
B. BSP驗(yàn)證。每個(gè)圓圈代表一個(gè)CpG位點(diǎn)，●表示甲基化位點(diǎn)，○表示未甲基化位點(diǎn)。
C-D. 在從Idh1^WT/WTKsp^Cre組和Idh1^WT/MutKsp^Cre小鼠分離的PTCs中，通過(guò)RT-PCR定量和WB分析NDUFA1相對(duì)于β-actin的表達(dá)。n=6，****P<0.0001。
E. 使用MSssI處理和熒光素酶活性組合來(lái)確定CpG甲基化是否直接促進(jìn)Ndufa1基因轉(zhuǎn)錄抑制。與對(duì)照細(xì)胞（未用MSssI處理的片段）相比，含有Ndufa1啟動(dòng)子報(bào)告基因構(gòu)建的293T細(xì)胞經(jīng)MssI處理后熒光素酶活性顯著下調(diào)，
F. 當(dāng)IDH-R132H過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或?qū)φ张cpGL4-Ndufa1和Renilla熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞時(shí)，與Idh1^WT/WT組相比，Idh1^WT/Mut組熒光素酶活性降低。

（5）NDUFA1參與IDH1-R132H突變型腎小管上皮細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激

圖5：NDUFA1在IDH1-R132H突變的腎小管上皮細(xì)胞中參與順鉑誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。

A. 代表性PI染色圖像描述Idh1^WT/WTKsp^Cre和Idh1^WT/MutKsp^Cre小鼠中分離順鉑誘導(dǎo)的PTCs細(xì)胞死亡。
B. 使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細(xì)胞死亡。
C. 通過(guò)Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示NDUFA1過(guò)表達(dá)減輕了順鉑誘導(dǎo)的IDH1-R132H突變腎小管上皮細(xì)胞的線粒體功能障礙。
D. 使用MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針?lè)謩e檢測(cè)感染空載體（vector）或Flag-NDUFA1慢病毒的Idh1^WT/WT和Idh1^WT/Mut PTCs的MitoROS生成、ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)ROS水平，并通過(guò)FACS進(jìn)行分析。
E. 代表性PI染色圖像顯示Ndufa1和Ndufa1^+/+-/- HK-2細(xì)胞受順鉑誘導(dǎo)死亡。
F. PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細(xì)胞死亡。
G. 通過(guò)Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示Ndufa1缺失加劇順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的線粒體功能障礙。
H. MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測(cè)Ndufa1和Ndufa1^+/+-/-腎小管細(xì)胞的MitoROS生成、ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)ROS水平，顯示Ndufa1缺失加劇了順鉑誘導(dǎo)的腎小管損傷。

（6）NDUFA1 通過(guò)與 FSP1 相互作用抑制線粒體氧化應(yīng)激

圖6：NDUFA1通過(guò)調(diào)節(jié)FSP1來(lái)調(diào)控順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。

A. 免疫共沉淀驗(yàn)證NDUFA1和FSP1之間的直接互作。HEK293T細(xì)胞被共轉(zhuǎn)染帶有Flag-FSP1和HA-NDUFA1的質(zhì)粒，隨后使用抗Flag M2磁珠進(jìn)行免疫共沉淀以拉下Flag-FSP1。結(jié)果表明NDUFA1和FSP1之間存在直接互作。
B. 鄰近連接分析（PLA）檢測(cè)了順鉑處理24小時(shí)后腎小管上皮細(xì)胞中FSP1和NDUFA1之間的物理相互作用。紅色點(diǎn)表示PLA陽(yáng)性信號(hào)。細(xì)胞核用Hoechst染色進(jìn)行反向染色。
C. 使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察順鉑處理24小時(shí)后腎小管上皮細(xì)胞中FSP1和NDUFA1的共定位。
D. 從Idh1^WT/WTKsp^Cre和Idh1^WT/MutKsp^Cre小鼠中分離出PTCs，PTCs感染空載體或Flag-Fsp1慢病毒后，加入25 μm順鉑。代表性PI染色圖像顯示順鉑誘導(dǎo)PTC死亡。
E. 使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細(xì)胞死亡。
F. Mitotracker和MitoSOX探針染色PTCs。
G. 在PTCs中使用MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測(cè)ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)ROS水平。

圖7：Fsp1缺失增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的鐵死亡和氧化應(yīng)激在腎小管上皮細(xì)胞中的作用。

A. 代表性PI染色圖像顯示Fsp1和Fsp1^+/+-/-小鼠腎小管上皮細(xì)胞（TEC）被順鉑誘導(dǎo)的死亡。
B. PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細(xì)胞死亡。
C. 通過(guò)Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示Fsp1缺失加劇了順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙
D. 在Fsp1和Fsp1^+/+-/-細(xì)胞中使用MitoSox、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測(cè)ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)ROS水平，顯示Fsp1缺失加劇了順鉑誘導(dǎo)的腎小管損傷。
E. IDH1-R132H加劇順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷（Cis-AKI）機(jī)制示意圖。

易小結(jié)
本研究結(jié)果表明IDH1-R132H突變通過(guò)增加Ndufa1啟動(dòng)子甲基化，抑制NDUFA1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，破壞NDUFA1與FSP1互作，從而影響FSP1在線粒體中的定位及其將CoQ還原為CoQH2的能力，導(dǎo)致ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物積累，進(jìn)而加劇順鉑誘導(dǎo)的氧化損傷和鐵死亡在腎小管上皮細(xì)胞中的發(fā)生。

研究亮點(diǎn)

揭示鐵死亡和氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián)：研究強(qiáng)調(diào)了鐵死亡在順鉑誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用，并揭示了NDUFA1-FSP1軸在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中的重要性。
提示新分子機(jī)制：本研究揭示了IDH1-R132H突變通過(guò)表觀遺傳機(jī)制影響線粒體功能，進(jìn)而影響腎臟對(duì)順鉑的響應(yīng)。
提供個(gè)性化治療策略：研究結(jié)果為攜帶IDH1-R132H突變的腫瘤患者提供了個(gè)性化治療策略的寶貴見(jiàn)解。

參考文獻(xiàn)：
Lai K, Chen Z, Lin S, Ye K, Yuan Y, Li G, Song Y, Ma H, Mak TW, Xu Y. The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction. Cell Death Differ. 2024 Sep 22. pii: 10.1038/s41418-024-01381-8. doi: 10.1038/s41418-024-01381-8. PubMed PMID: 39306640.

索取資料

來(lái)源：深圳市易基因科技有限公司
聯(lián)系電話：0755-28317900
E-mail：wuhuanhuan@e-gene.cn

【點(diǎn)擊可查看深圳市易基因科技有限公司相關(guān)服務(wù)】

標(biāo)簽： DNA甲基化

分享到：QQ空間新浪微博騰訊微博微信

【所有文章】【本類新聞】【相關(guān)服務(wù)】【關(guān)閉窗口】

本類文章

本類新聞

综合图区亚洲网友自拍|亚洲黄色网络|成人无码网WWW在线观看,日本高清视频色视频kk266,激情综合五月天,欧美一区日韩一区中文字幕页

RRBS等揭示IDH1-R132H突變通過(guò)DNA甲基化加劇順鉑誘導(dǎo)腎毒性