肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）早期復(fù)發(fā)仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域，其中涉及的機(jī)制尚未完全被理解。盡管微血管侵犯（Microvascular invasion，MVI）與HCC早期復(fù)發(fā)相關(guān)，但缺乏用于診斷和預(yù)后評(píng)估的理想生物標(biāo)志物。DNA甲基化和長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為表觀遺傳調(diào)控因子，在HCC中的表達(dá)變化與疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。因此，鑒定可以預(yù)測肝癌患者預(yù)后的DNA甲基化位點(diǎn)，并闡明驅(qū)動(dòng)HCC侵襲性的分子機(jī)制至關(guān)重要。

近日，《Experimental & Molecular Medicine》期刊發(fā)表了題為“VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma“的研究論文，該研究探討了在肝細(xì)胞癌（HCC）中，通過CpG甲基化調(diào)控的非編碼RNA VIM-AS1（vimentin antisense RNA1）（一種1.8 kb長的非編碼RNA）與IGF2BP1合作，通過EPHA3降解來抑制腫瘤侵襲性。研究發(fā)現(xiàn)，VIM-AS1高甲基化與HCC預(yù)后不良相關(guān)，并能夠通過影響EPHA3 mRNA穩(wěn)定性來調(diào)控HCC侵襲性。

標(biāo)題：VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma（VIM-AS1 受 CpG 甲基化調(diào)控，與 IGF2BP1 協(xié)同作用，通過降解 EPHA3 抑制肝細(xì)胞癌中的腫瘤侵襲性）
期刊：Experimental & Molecular Medicine（Exp Mol Med）
影響因子：IF 9.5
技術(shù)平臺(tái)：BS、ChIP-seq、MeRIP-seq分析、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
 
本研究首先利用CGRC和TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC患者樣本的DNA甲基化數(shù)據(jù)，鑒定出HCC中的高甲基化CpG位點(diǎn)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果揭示了cg02746869是VIM-AS1的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)。調(diào)控VIM-AS1表達(dá)的HCC細(xì)胞RNA-seq測序揭示了EPHA3是VIM-AS1的病理靶標(biāo)，在HCC中發(fā)揮致癌作用。高甲基化導(dǎo)致的VIM-AS1表達(dá)抑制顯著影響HCC細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，尤其損害細(xì)胞的移動(dòng)性和侵襲性。從機(jī)制上講，VIM-AS1表達(dá)降低通過增強(qiáng)IGF2BP1與EPHA3 mRNA的結(jié)合來穩(wěn)定EPHA3 mRNA，導(dǎo)致EPHA3 mRNA表達(dá)增加，并促進(jìn)HCC進(jìn)展。進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VIM-AS1-EPHA3軸調(diào)控HCC的腫瘤生長和腫瘤微環(huán)境。以上研究結(jié)果表明，cg02746869位點(diǎn)高甲基化導(dǎo)致的VIM-AS1下調(diào)通過m6A依賴性機(jī)制增加EPHA3 mRNA表達(dá)，從而增加HCC侵襲性。
 
結(jié)果圖形
（1）cg02746869 甲基化狀態(tài)調(diào)控 VIM-AS1 在 HCC 中的表達(dá)
 

圖1：DNA甲基化分析揭示HCC患者VIM-AS1中cg02746869位點(diǎn)的高甲基化狀態(tài)。

a. 根據(jù)CGRC和TCGA數(shù)據(jù)庫的甲基化組數(shù)據(jù)，示意圖顯示在HCC中鑒定出的50個(gè)高甲基化位點(diǎn)（左圖）；50個(gè)高甲基化位點(diǎn)位于CpG islands、CpG shores、CpG shelves和open sea區(qū)域（中間圖）；50個(gè)高甲基化位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）之間的距離分布（右圖）。
b. 在多種惡性腫瘤中cg02746869位點(diǎn)的beta值分析。
c. 熱圖表示不同類型癌癥中VIM-AS1表達(dá)和cg02746869甲基化模式（左圖）。cg02746869位點(diǎn)的beta值與VIM-AS1表達(dá)水平的相關(guān)性分析（右圖）。
d. 在THLE2和HUH1中cg02746869位點(diǎn)的甲基化和相關(guān)VIM-AS1表達(dá)。
e. 在DNMT3A實(shí)驗(yàn)組中使用HRM和BS-seq驗(yàn)證甲基化水平增加，并檢測到VIM-AS1表達(dá)下調(diào)。在TET1實(shí)驗(yàn)組中使用HRM和BS-seq驗(yàn)證甲基化水平下降，并驗(yàn)證了VIM-AS1表達(dá)。
f. H3K27ac and H3K4me3的ChIP-seq基因組瀏覽器顯示THLE2和HUH1中cg02746869位點(diǎn)活性標(biāo)記富集結(jié)果。
g. 甲基化和去甲基化后cg02746869位點(diǎn)的ChIP-qPCR用于評(píng)估組蛋白活性和轉(zhuǎn)錄因子（TF）結(jié)合。Con =對(duì)照組，DNMT3A = 高甲基化cg02746869位點(diǎn)，TET1 = 低甲基化cg02746869位點(diǎn)。

（2）VIM-AS1過表達(dá)抑制癌細(xì)胞侵襲性
 

圖2：VIM-AS1水平整體升高進(jìn)而下調(diào)與細(xì)胞粘附相關(guān)的基因。

a. 使用FISH檢測VIM-AS1定位的代表性圖像（左圖）。VIM-AS1相對(duì)強(qiáng)度，表示亞細(xì)胞定位的百分比（中間圖）。THLE2和HUH1之間每種亞細(xì)胞定位強(qiáng)度比較（右圖）。
b. 通過qRT-PCR（左圖）和RNA-seq（右圖）驗(yàn)證VIM-AS1過表達(dá)細(xì)胞。
c. 在VIM-AS1過表達(dá)后上調(diào)和下調(diào)基因的差異表達(dá)基因（DEG）相關(guān)性分析圖（左圖）。紅色=前5個(gè)上調(diào)基因；藍(lán)色=前5個(gè)下調(diào)基因。VIM-AS1下調(diào)的DEG的GO分析（右圖）。
d. 與細(xì)胞粘附相關(guān)下調(diào)DEG的GSEA結(jié)果。
e. VIM-AS1過表達(dá)細(xì)胞中細(xì)胞粘附相關(guān)基因qRT-PCR。
f. 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的代表性圖像和定量分析。

（3）VIM-AS1 調(diào)控EPHA3 mRNA穩(wěn)定性
 

圖3：VIM-AS1調(diào)節(jié)EPHA3 mRNA穩(wěn)定性，與HCC預(yù)后不良相關(guān)。

a. THLE2、HUH1以及甲基化修飾樣本中EPHA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。顯示EPHA3 mRNA表達(dá)量對(duì)VIM-AS1調(diào)控的響應(yīng)變化。VIM-AS1 OE = VIM-AS1過表達(dá)，VIM-AS1 KD = VIM-AS1敲低。
b. 使用放線菌素D處理HUH1細(xì)胞后EPHA3 mRNA的RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
c. VIM-AS1過表達(dá)后EPHA3蛋白的免疫印跡圖。
d. EPHA3 mRNA敲低后的細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。
e. 使用GEPIA分析了不同階段VIM-AS1和EPHA3 RNA的表達(dá)量。
f. Kaplan-Meier生存曲線分析所有HCC患者以及微血管侵犯（MVI）患者EPHA3 mRNA預(yù)后生存率。

（4）EPHA3 mRNA 穩(wěn)定性通過 IGF2BP1 與 m6A 位點(diǎn)結(jié)合來確定

圖4：IGF2BP1以m6A依賴性方式破壞EPHA3 mRNA穩(wěn)定性。

a. 基因組瀏覽器快照顯示GSE928399中HEK293T細(xì)胞EPHA3 MeRIP-seq的m6A修飾位點(diǎn)（頂部），使用RM2Target預(yù)測m6A位點(diǎn)（中間）以及實(shí)驗(yàn)靶向的3′UTR m6A位點(diǎn)區(qū)域（底部）。EPHA3的3′ UTR的MeRIP-qPCR結(jié)果。
b. HCC腫瘤組織（T）相對(duì)于正常組織（N）中m6A修飾因子的差異表達(dá)；FC=倍數(shù)變化。
c. RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示HUH1細(xì)胞中與IGF2BP1結(jié)合的EPHA3和VIM-AS1 RNA。
d. IGF2BP1沉默對(duì)EPHA3 mRNA表達(dá)的影響。
e. 對(duì)包括m6A位點(diǎn)在內(nèi)的EPHA3 3′UTR野生型（WT）和突變型（MUT）構(gòu)建體的MeRIP-qPCR分析。
f. 在IGF2BP1沉默后使用WT和MUT構(gòu)建體進(jìn)行的熒光素酶實(shí)驗(yàn)。

（5）VIM-AS1 干擾 IGF2BP1 與 EPHA3 結(jié)合

圖5：VIM-AS1通過抑制IGF2BP1與EPHA3 mRNA的互作來調(diào)節(jié)EPHA3 mRNA表達(dá)。

a-b. RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，在HUH1細(xì)胞中VIM-AS1過表達(dá)（a）和在THLE2細(xì)胞中VIM-AS1敲低（b）后，VIM-AS1和EPHA3 mRNA對(duì)IGF2BP1的結(jié)合親和力。
c. 示意圖顯示VIM-AS1表達(dá)增加/減少對(duì)EPHA3 mRNA的影響如何通過IGF2BP1介導(dǎo)。
d. FISH結(jié)果顯示VIM-AS1和IGF2BP1（左圖）以及EPHA3 mRNA和IGF2BP1（右圖）定位。條形圖顯示每個(gè)FISH數(shù)據(jù)集相對(duì)共定位熒光強(qiáng)度。白色箭頭=VIM-AS1或EPHA3 mRNA與IGF2BP1共定位區(qū)域。

（6）EPHA3 mRNA在與肝細(xì)胞癌（HCC）相關(guān)的成纖維細(xì)胞中富集。

圖6：VIM-AS1-EPHA3軸調(diào)控基因參與HCC侵襲性。

a. 在VIM-AS1過表達(dá)細(xì)胞和VIM-AS1與EPHA3共過表達(dá)細(xì)胞中VIM-AS1和EPHA3的相對(duì)表達(dá)量。
b. GSEA顯示與細(xì)胞粘附相關(guān)的基因。紅色條形=因VIM-AS1過表達(dá)而表達(dá)量減少、但在VIM-AS1和EPHA3都過表達(dá)時(shí)增加的DEGs。
c. 基因網(wǎng)絡(luò)分析揭示，由VIM-AS1調(diào)節(jié)的EPHA3 mRNA與EPHA3 mRNA表達(dá)量一同下調(diào)/上調(diào)。
d. 與EPHA3 mRNA協(xié)同調(diào)控基因的單細(xì)胞RNA-seq圖譜（GSE149614）。

（7）VIM-AS1 過表達(dá)抑制 EPHA3 mRNA 并減少體內(nèi)腫瘤發(fā)生

圖7：VIM-AS1抑制肝細(xì)胞癌中腫瘤微環(huán)境的變化。

a. 每組腫瘤體積和重量變化圖表。
b. 從每組切除的腫瘤圖像。
c. 細(xì)胞和結(jié)構(gòu)變化的HE染色切片。
d. 膠原沉積的天狼星紅染色。
e. 馬松三色染色及膠原沉積面積的定量。
f. α-SMA（頂部）和CD31（底部）的IF染色及定量。白色箭頭= CD31陽性血管。Con=對(duì)照組，VIM-AS1 = VIM-AS1過表達(dá)，VIM-AS1/EPHA3 = VIM-AS1和EPHA3共過表達(dá)。

易小結(jié)
本研究通過BS-seq和ChIP-seq及對(duì)應(yīng)的RNA-seq分析揭示了cg02746869是VIM-AS1的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，其高甲基化與VIM-AS1的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。VIM-AS1下調(diào)通過增強(qiáng)IGF2BP1與EPHA3 mRNA結(jié)合，增加EPHA3 mRNA表達(dá)，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。在HCC細(xì)胞中，VIM-AS1過表達(dá)能夠降低與細(xì)胞粘附相關(guān)基因表達(dá)，并抑制HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在動(dòng)物模型中，VIM-AS1過表達(dá)抑制了腫瘤生長和腫瘤微環(huán)境變化。

研究結(jié)果表明，VIM-AS1表達(dá)受CpG甲基化調(diào)控，其下調(diào)通過m6A依賴性機(jī)制增加了EPHA3 mRNA表達(dá)，從而增加HCC侵襲性。VIM-AS1和EPHA3可能作為HCC診斷和治療的表觀遺傳標(biāo)記。

本研究揭示了VIM-AS1通過表觀遺傳機(jī)制調(diào)控HCC侵襲性的新途徑。確定了VIM-AS1和EPHA3在HCC進(jìn)展中的重要作用，為HCC的治療提供了新的靶點(diǎn)。并提供了基于表觀遺傳學(xué)的標(biāo)志物，可能改善HCC的早期檢測和預(yù)后評(píng)估。

參考文獻(xiàn)：
Han SH, Ko JY, Jung S, Oh S, Kim DY, Kang E, Kim MS, Chun KH, Yoo KH, Park JH. VIM-AS1, which is regulated by CpG methylation, cooperates with IGF2BP1 to inhibit tumor aggressiveness via EPHA3 degradation in hepatocellular carcinoma. Exp Mol Med. 2024 Dec 2. pii: 10.1038/s12276-024-01352-6. doi: 10.1038/s12276-024-01352-6. PubMed PMID: 39617786.