01.技術簡述
細胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指在生物體的體液中（如血漿、尿液、腦脊液等）自由存在的、非細胞內的DNA片段。這些DNA片段通常來源于細胞凋亡（程序性死亡）或壞死（細胞損傷或死亡后釋放），可以被釋放到循環(huán)系統中，并在體液中被檢測到。cfDNA研究和應用是精準醫(yī)療和液體活檢領域的重要方向之一。
 

02.技術優(yōu)勢

腦脊液樣本：通常作為中樞神經系統疾病研究的樣本選擇。

尿液樣本：常用于泌尿系統癌癥如膀胱癌、腎癌等腫瘤標志物研究及移植排異監(jiān)測等cfDNA 研究。

血漿樣本要求
樣本采集：靜脈抽血5-10ml，收集到EDTA 抗凝血管中，上下顛倒抗凝采血管，輕輕混勻，全血2-8℃保存不超過4h；如用Streck 采血管收集全血，則5-8℃保存不超過72h。

分離血漿：采血后建議馬上分離血漿，提取cfDNA，-20℃保存；如不能馬上提取，常規(guī)采血管采血后必須4h 內（最好30min-1h 內）完成血漿分離，-80℃保存。

樣本運輸：大體積干冰運輸。

04.研究案例
案例1：ctDNA全基因組亞硫酸鹽測序分析，用于癌癥檢測和分子分類
發(fā)表期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：8.554/1區(qū)
方法：ctDNA-WGBS

此研究納入三組乳腺癌（BC）患者（BC組n=123；健康對照組n=40），利用ctDNA-WGBS技術檢測從200μL血漿中獲得的微量ctDNA（輸入量約1ng）進行測序分析。研究結果發(fā)現，在多中心患者隊列中，在早期和晚期BC階段中對于15個ctDNA甲基化標志物的診斷特征表現出高準確性。同時可以在不同的癌癥類型（包括肝細胞癌和肺癌）中可以很好區(qū)分雌激素受體狀態(tài)的ctDNA甲基化特征。
 

圖：ctDNA甲基化可以作為乳腺癌亞型分類和預測ER狀態(tài)的潛在生物標志物[3]

案例2：MeDIP-seq結合機器學習方法，為多癌種生物標志物檢測提供新思路
期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7 / 1區(qū)
技術平臺：cfMeDIP-seq等
此研究通過結合cfMeDIP-seq技術和機器學習，分析了215例樣本的cfDNA甲基化組，包括患有肝癌或腦癌的個體樣本（實驗組）以及無癌癥個體樣本（對照組）。利用DMRs、DhMRs或DMRs+DhMRs訓練機器學習模型，結果發(fā)現DMRs+DhMRs聯合模型在區(qū)分對照組、肝癌和腦癌方面表現出更優(yōu)性能，研究支持同時利用DMRs和DhMRs進行多癌種檢測的潛力。
 

圖：用于分析血漿cfDNA甲基化的單鏈cfDNA甲基化DNA免疫沉淀測序方法[4]

案例3：ACE-seq無需亞硫酸鹽轉化精準區(qū)分甲基化和羥甲基化標記
此研究建立一種利用DNA脫氨酶（APOBEC3A）實現的非破壞性的、低起始DNA量的鑒定5hmC技術（ACE-seq）。與傳統亞硫酸鹽測序（BS-Seq）不同，ACE-seq不依賴于亞硫酸鹽處理，而是通過酶促脫氨反應來區(qū)分未修飾的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5mC），同時保護5hmC不被轉化為尿嘧啶。這種方法允許對cfDNA中的5hmC進行精確的定位和定量分析。
 

圖：幾類基因組元件的 5hmC（藍色）和 5mC（紅色）的修飾水平[2]

案例4：cfhMeDIP-seq對5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）特征進行檢測以預測早期胰腺癌
此研究利用cfDNA hMeDIP-seq對胰腺導管腺癌（PDAC）隊列（n=64）與非癌癥隊列（n=243）的5hmC變化進行比較分析。在數千個基因中鑒定差異性羥甲基化，結果表明胰腺發(fā)育或功能相關基因和癌癥發(fā)病機制相關基因差異最為顯著。在PDAC隊列的cfDNA羥甲基化組中，與KRAS激活和TP53失活在PDAC腫瘤中常見基因調控失調相關的基因表現出差異性富集，表明5hmC變化在早期疾病階段能實現PDAC分類。
 

圖：與非癌癥患者cfDNA相比，PDAC cfDNA中的5hmC占位差異分析[5]

案例5：cfChIP-seq利用cfDNA片段分析組蛋白修飾，揭示H3K27ac水平與cfDNA片段大小有關
此研究利用cfChIP-seq檢測技術從18個健康對照樣本中獲得H3K27ac信號，并結合配對樣本分析循環(huán)核小體的cfDNA片段大小模式和H3K27ac信號之間的相關性。隨后構建線性回歸模型，可根據cfDNA片段大小模式推斷血漿中H3K27ac水平（H3K27ac相關信號）。分析發(fā)現H3K27ac相關信號與cfChIP-seq測定的H3K27ac相關信號一致。
 

圖：cfChIP-seq揭示H3K27ac水平與cfDNA片段大小之間的關系[7]

案例6：cfDNA低覆蓋度WGS揭示腫瘤患者的全基因組突變特征
此研究對215名患者和227名健康人群的血漿進行全基因組測序（WGS），鑒定出病理性和生理性突變特征。
 

圖：多種癌癥類型的血漿基因突變特征檢測[6]

05.參考文獻
① Shen SY, Burgener JM, Bratman SV, De Carvalho DD. Preparation of cfMeDIP-seq libraries for methylome profiling of plasma cell-free DNA. Nat Protoc. 2019 Oct;14(10):2749-2780. pii: 10.1038/s41596-019-0202-2. doi: 10.1038/s41596-019-0202-2. PubMed PMID: 31471598.

② Schutsky EK, et al.Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. Nat Biotechnol. 2018 Oct 8. pii: nbt.4204. doi: 10.1038/nbt.4204. PubMed PMID: 30295673.

③ Gao Y, et al. Whole-genome bisulfite sequencing analysis of circulating tumour DNA for the detection and molecular classification of cancer. Clin Transl Med. 2022 Aug;12(8):e1014. doi: 10.1002/ctm2.1014. PubMed PMID: 35998020.

④ Hua X, et al. Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA. Nat Commun. 2024 Jul 20;15(1):6113. pii: 10.1038/s41467-024-50471-1. doi: 10.1038/s41467-024-50471-1. PubMed PMID: 39030196.

⑤ Guler GD,et al. Detection of early stage pancreatic cancer using 5-hydroxymethylcytosine signatures in circulating cell free DNA. Nat Commun. 2020 Oct 19;11(1):5270. pii: 10.1038/s41467-020-18965-w. doi: 10.1038/s41467-020-18965-w. PubMed PMID: 33077732.

⑥ Wan JCM, et al. Genome-wide mutational signatures in low-coverage whole genome sequencing of cell-free DNA. Nat Commun. 2022 Aug 23;13(1):4953. pii: 10.1038/s41467-022-32598-1. doi: 10.1038/s41467-022-32598-1. PubMed PMID: 35999207.

⑦ Bai J, et al. Histone modifications of circulating nucleosomes are associated with changes in cell-free DNA fragmentation patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Oct 15;121(42):e2404058121. doi: 10.1073/pnas.2404058121. PubMed PMID: 39382996.