單細胞WGBS揭示母源蛋白調(diào)控早期胚胎發(fā)育的DNA甲基化重編程機制
哺乳動物的早期胚胎發(fā)育會經(jīng)歷重要的表觀遺傳重編程過程，這一過程需要重置從親本基因組繼承的表觀遺傳信息，以啟動胚胎基因表達程序，而全基因組去甲基化對表觀遺傳重編程至關(guān)重要。哺乳動物基因組在CpG位點上有較高水平的甲基化，主要以5-甲基胞嘧啶（5mC）的形式存在。早期胚胎發(fā)育的一個顯著特征是DNA甲基化廣泛丟失，尤其在第一次細胞分裂期間。這一過程在哺乳動物中保守，但在去甲基化動態(tài)和程度上存在差異。全基因組去甲基化過程對早期胚胎的發(fā)育能力至關(guān)重要，具有高甲基化基因組的小鼠胚胎表現(xiàn)出異常。哺乳動物中，與全基因組DNA甲基化減少相關(guān)的生物學過程相對異常。因此早期胚胎具有特異性調(diào)控機制，但這些機制目前尚部分未知。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）在這個階段主要被排除在細胞核外，但其核內(nèi)活性是否受其他機制調(diào)節(jié)尚不明確。
近日，中國科學院生物物理研究所朱冰和張珠強團隊共同研究發(fā)現(xiàn)，母源蛋白Pramel15通過泛素-蛋白酶體通路系統(tǒng)靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）進行降解，調(diào)節(jié)其在早期胚胎細胞核中的DNA甲基化水平，影響DNA去甲基化過程。這一發(fā)現(xiàn)首次揭示早期胚胎細胞核中存在著依賴于蛋白酶體的DNMT1調(diào)控機制，幫助受精卵（合子）DNA去甲基化。相關(guān)研究成果以“Pramel15 facilitates zygotic nuclear DNMT1 degradation and DNA demethylation“為題發(fā)表在Nature子刊《Nature Communications》。
標題：Pramel15 facilitates zygotic nuclear DNMT1 degradation and DNA demethylation（Pramel15促進受精卵細胞核的DNMT1降解和DNA去甲基化）
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7/1區(qū)
技術(shù)平臺：單細胞/微量WGBS、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
本研究首先假設(shè)早期胚胎中存在調(diào)控整體 DNA 去甲基化過程的未知調(diào)節(jié)機制，并通過尋找 DNA 甲基化的新調(diào)節(jié)因子來研究這一假設(shè)，其表達對早期胚胎具有特異性。為此，研究首先鑒定出一個母源蛋白 Pramel15，Pramel15通過Cullin-RING E3連接酶靶向DNMT1進行降解，可調(diào)節(jié)胚胎核內(nèi) DNMT1 的蛋白水平。而Pramel15 缺失會提高合子原核中的DNMT1水平，損害合子DNA去甲基化，并導(dǎo)致小鼠早期胚胎在全基因組中表現(xiàn)出 DNA 甲基化水平的隨機增加。本研究揭示Pramel15可以在受精卵DNA復(fù)制過程中調(diào)控細胞核中的DNMT1水平，從而確保早期胚胎中有效的DNA甲基化重編程。這些發(fā)現(xiàn)將有助于進一步理解調(diào)控哺乳動物 DNA 甲基化重編程的復(fù)雜機制。
研究方法
結(jié)果圖形
（1）篩選鑒定促進DNA去甲基化因子Pramel15，Pramel15過表達導(dǎo)致整體DNA去甲基化
b. 左側(cè)熒光圖像顯示B2-17轉(zhuǎn)染Pramel15表達質(zhì)粒后GFP激活的細胞。右側(cè)條形圖顯示使用流式細胞排序（FACS）的B2-17轉(zhuǎn)染Pramel15表達質(zhì)粒后GFP陽性細胞比例。進行三次生物學重復(fù)。
c. BS-seq顯示B2-17細胞轉(zhuǎn)染Pramel15表達質(zhì)粒后CMV啟動子的DNA甲基化狀態(tài)。96小時后提取基因組DNA，然后進行CMV啟動子的亞硫酸鹽測序。
d. 條形圖顯示B2-17基因組中5-甲基胞嘧啶（mC）和5-羥甲基胞嘧啶（hmC）的相對水平。細胞在Pramel15表達后的1-4天收獲，提取基因組DNA進行核苷質(zhì)量譜分析。參照第0天細胞的5mC水平進行歸一化。
e. B2-17基因組DNA在轉(zhuǎn)染表達Pramel15-mCherry或mCherry的質(zhì)粒后提取進行核苷質(zhì)量譜分析。
（2）Pramel15與DNMT1 RFTS結(jié)構(gòu)域互作并調(diào)節(jié)DNMT1蛋白穩(wěn)定性
圖2：Pramel15與DNMT1互作，并通過泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)DNMT1降解。
a. 293FT細胞轉(zhuǎn)染Pramel15-HA和DNMT1-Flag（上）或UHRF1-Flag（下）表達質(zhì)粒后的Flag免疫沉淀。
b. 高含量圖像顯示有無Pramel15-mCherry誘導(dǎo)的DNMT1-GFP水平，通過多西環(huán)素（Dox）處理48小時（左），箱線圖顯示DMSO組（n=3973）和Dox組（n=3109）的統(tǒng)計結(jié)果（右）。
c. 在表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的T-REx293細胞中，DNMT1蛋白水平的Western Blot分析，
d. DNMT1及其截短體的示意圖。
e-f. 293FT細胞轉(zhuǎn)染DNMT1-Flag或其截短體和Pramel15-HA表達質(zhì)粒后的Flag免疫沉淀。
g. 293FT細胞中有無Pramel15-HA的Flag-DNMT1和Flag-DNMT1(Δ350-609aa)蛋白水平Western Blot分析。
h. 在表達Flag-DNMT1(350-609aa)和Dox誘導(dǎo)的Pramel15-HA的mES細胞中，F(xiàn)lag-DNMT1(350-609aa)蛋白水平的Western Blot分析。
i. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達His-ubiquitin、Flag-DNMT1(1-609aa)和Pramel15-HA或空質(zhì)粒，并用20μM MG132處理后的Flag免疫沉淀。所有通過Western Blot分析的免疫沉淀和定量實驗至少重復(fù)三次。
（3）Cullin-RING連接酶參與Pramel15介導(dǎo)的DNMT1降解
圖3：Cullin-RING E3泛素連接酶參與Pramel15介導(dǎo)的DNMT1降解。
a. 在兩個獨立實驗中， mES細胞中Pramel15-Flag共免疫沉淀的蛋白質(zhì)無標簽質(zhì)譜分析。Pramel15、DNMT1和CRL5復(fù)合體的亞基（紅色高亮）是主要的富集標靶。
b. 表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的mES細胞中，有或沒有 2.5 μM MLN4924處理的DNMT1蛋白水平的Western Blot分析。
c. 表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的mES細胞和Cul5-KO mES細胞中，DNMT1蛋白水平的Western Blot分析。
d. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達Pramel15-HA和不同F(xiàn)lag標記的Cullin蛋白質(zhì)粒后的Flag免疫沉淀。
e. Cullin-RING E3泛素連接酶復(fù)合體的模型。不同的Cullin復(fù)合體包含不同接頭，Cul5與Rbx2結(jié)合，而其他Cullin蛋白與Rbx1結(jié)合。
f. 表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的mES細胞和Cul5-KO mES細胞中，有或沒有Rbx1 siRNA轉(zhuǎn)染的DNMT1蛋白水平的Western Blot分析（左）。四個生物學重復(fù)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)（右）。
（4）Pramel15介導(dǎo)DNMT1降解的主要motifs
b. Pramel15與含有BC和Cul2 box或BC和Cul5 box motif的蛋白質(zhì)的多序列比對，突出顯示保守的殘基。黑色表示相同的氨基酸，非常相似-深灰色，相似-淺灰色。星號標記保守的Pramel15殘基。
c. 預(yù)測的Pramel15 LRR motif序列，LRR序列模式（LXXLXL）中保守的亮氨酸用黃色突出顯示。
d. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達Pramel15-HA和Flag標記的Cul5的質(zhì)粒后的HA免疫沉淀。Western blot顯示DNMT1和Cul5與Pramel15、Pramel15(Δ2-121aa)和Pramel15(Δ268-402aa)的關(guān)聯(lián)。
e. Pramel15在BC-box、Cul2-box和Cul5-box的點突變體表格。
f. Western blot顯示在293FT細胞中表達Dox誘導(dǎo)HA標記的Pramel15突變體（如e所示）的DNMT1蛋白水平。
g. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達HA標記的Pramel15或N端突變體和Flag標記的Cul5的質(zhì)粒后的Flag免疫沉淀。Western blot顯示Cul5與Pramel15及其突變體的關(guān)聯(lián)。
h. 在293FT細胞中表達Dox誘導(dǎo)的HA標記的LRR motif突變體（根據(jù)圖4c，L/V/F替換為A）的Pramel15的DNMT1蛋白水平的Western blot。
i. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達Flag標記的DNMT1和HA標記的Pramel15或LRRs突變體（根據(jù)c，L/V/F替換為A）的質(zhì)粒，并用2.5μM MLN4924處理以防止DNMT1降解后的Flag免疫沉淀。Western blotting顯示DNMT1與Pramel15及其LRRs突變體的關(guān)聯(lián)。
（5）Pramel15基因敲除小鼠沒有明顯的發(fā)育和生育缺陷，Pramel15調(diào)節(jié)早期胚胎細胞核中DNMT1蛋白水平
圖5：母源性Pramel15缺失增加了胚胎核中的DNMT1水平。
a. Pramel15 mRNA和核糖體保護片段（RPF）在早期發(fā)育過程中的動態(tài)變化線圖，以及顯示翻譯效率（RPF/mRNA）的條形圖。源數(shù)據(jù)：GSE165782。
b. 通過顯微注射Pramel15-mCherry mRNA在GV期卵母細胞、合子（受精卵）和2C胚胎中Pramel15的定位代表性熒光圖像。三次重復(fù)。
c. 高含量成像分析系統(tǒng)獲取的圖像的3D重建示意圖。
d. 野生型（WT，n=118）和Pramel15基因敲除（KO，n=118）卵母細胞的受精卵核中相對DNMT1強度條形圖。
e. 雄性（WT，n=58；KO，n=56）和雌性（WT，n=57；KO，n=60）原核中相對DNMT1強度條形圖，原核根據(jù)核大小來定義。
f. 受精卵（合子）（WT，n=49；KO，n=45）、2細胞胚胎（2C）（WT，n=67；KO，n=57）、4細胞胚胎（4C）（WT，n=73；KO，n=71）、8細胞胚胎（8C）（WT，n=139；KO，n=124）和囊胚（WT，n=337；KO，n=185）核中相對DNMT1強度條形圖。DNMT1強度在每個階段都參照WT組進行歸一化。
g-h. 用DMSO（WT，n=107；KO，n=145）、MG132（WT，n=100；KO，n=127）和MLN4924（WT，n=126；KO，n=143）處理的受精卵（合子）核中相對DNMT1強度條形圖。合子在受精后2小時轉(zhuǎn)移到含有DMSO、10μM MG132和5μM MLN4924的HTF中，進一步培養(yǎng)額外的9小時。
i. 基因組被劃分為1Mb bins。歸一化DNMT1 CUT&RUN計數(shù)代表DNMT1水平。
j. 每個相應(yīng)基因組bins中DNMT1水平由歸一化計數(shù)表示。基因組 bins根據(jù)MII期卵母細胞中H3K9me3 ChIP-seq reads排序。H3K9me3 ChIP-seq數(shù)據(jù)來源：GSM2588560。
（6）Pramel15 缺失胚胎中 DNA 甲基化水平增加
d.受精卵中父本和母本基因組的全基因組DNA甲基化水平，分別通過DBA/2J和C57BL/J的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）進行區(qū)分。
e. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖(parthenogenesis)1細胞胚胎的全基因組DNA甲基化水平。
f. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎之間1Mb bins的平均CpG甲基化差異箱線圖�；蚪Mbins根據(jù)DNMT1 CUT&RUN信號增加排序。
g. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎之間1Mb bins的平均CpG甲基化差異條形圖�；蚪Mbin根據(jù)MII期卵母細胞中H3K9me3 ChIP-seq reads排序。
h. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎中CpG甲基化和H3K9me3密度差異基因組瀏覽器視圖。H3K9me3 ChIP-seq數(shù)據(jù)來源：GSM2588560。
i. MII期卵母細胞中1kb bins的CpG甲基化變化和CpG數(shù)量相關(guān)性分析。
j. DNA復(fù)制過程中1kb bins的DNA甲基化維持效率，展示了復(fù)制耦合（0分鐘）和復(fù)制后5分鐘的情況。數(shù)據(jù)來源：GSE131098。
k. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎中1kb bins的平均CpG甲基化差異（mCG%KO− mCG%het），按MII期卵母細胞中1kb bins總甲基化CpG數(shù)量平均值排序。
易小結(jié)
本研究首先揭示了Pramel15通過Cullin-RING E3泛素連接酶復(fù)合體促進DNMT1降解。同時Pramel1的缺失導(dǎo)致受精卵細胞核中DNMT1水平升高，影響受精卵DNA去甲基化，并在早期胚胎中引起DNA甲基化水平的隨機增加。此外，Pramel15基因敲除小鼠表現(xiàn)顯著的DNA甲基化增加，但并未觀察到明顯的發(fā)育或生育缺陷。
研究結(jié)果表明Pramel15通過調(diào)節(jié)DNMT1在核內(nèi)的豐度，精細調(diào)控整體去甲基化過程，這對于早期胚胎的表觀遺傳重編程至關(guān)重要。
研究亮點
參考文獻：Tan J, Li Y, Li X, Zhu X, Liu L, Huang H, Wei J, Wang H, Tian Y, Wang Z, Zhang Z, Zhu B. Pramel15 facilitates zygotic nuclear DNMT1 degradation and DNA demethylation. Nat Commun. 2024 Aug 25;15(1):7310. pii: 10.1038/s41467-024-51614-0. doi: 10.1038/s41467-024-51614-0. PubMed PMID: 39181896.
近日，中國科學院生物物理研究所朱冰和張珠強團隊共同研究發(fā)現(xiàn)，母源蛋白Pramel15通過泛素-蛋白酶體通路系統(tǒng)靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）進行降解，調(diào)節(jié)其在早期胚胎細胞核中的DNA甲基化水平，影響DNA去甲基化過程。這一發(fā)現(xiàn)首次揭示早期胚胎細胞核中存在著依賴于蛋白酶體的DNMT1調(diào)控機制，幫助受精卵（合子）DNA去甲基化。相關(guān)研究成果以“Pramel15 facilitates zygotic nuclear DNMT1 degradation and DNA demethylation“為題發(fā)表在Nature子刊《Nature Communications》。
標題：Pramel15 facilitates zygotic nuclear DNMT1 degradation and DNA demethylation（Pramel15促進受精卵細胞核的DNMT1降解和DNA去甲基化）
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF 14.7/1區(qū)
技術(shù)平臺：單細胞/微量WGBS、RNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
本研究首先假設(shè)早期胚胎中存在調(diào)控整體 DNA 去甲基化過程的未知調(diào)節(jié)機制，并通過尋找 DNA 甲基化的新調(diào)節(jié)因子來研究這一假設(shè)，其表達對早期胚胎具有特異性。為此，研究首先鑒定出一個母源蛋白 Pramel15，Pramel15通過Cullin-RING E3連接酶靶向DNMT1進行降解，可調(diào)節(jié)胚胎核內(nèi) DNMT1 的蛋白水平。而Pramel15 缺失會提高合子原核中的DNMT1水平，損害合子DNA去甲基化，并導(dǎo)致小鼠早期胚胎在全基因組中表現(xiàn)出 DNA 甲基化水平的隨機增加。本研究揭示Pramel15可以在受精卵DNA復(fù)制過程中調(diào)控細胞核中的DNMT1水平，從而確保早期胚胎中有效的DNA甲基化重編程。這些發(fā)現(xiàn)將有助于進一步理解調(diào)控哺乳動物 DNA 甲基化重編程的復(fù)雜機制。
研究方法
- 基因表達分析：通過轉(zhuǎn)錄組和翻譯組分析，研究Pramel15在早期胚胎發(fā)育中的表達模式。
- 蛋白互作分析：利用免疫共沉淀（Co-IP）和質(zhì)譜分析，確定Pramel15與DNMT1互作。
- 細胞和分子生物學技術(shù)：包括CRISPR/Cas9基因編輯、免疫熒光、西方印跡（Western blot）等，用于研究Pramel15和DNMT1的功能。
- 表觀遺傳學分析：利用單細胞全基因組亞硫酸鹽測序（scWGBS）技術(shù)分析DNA甲基化水平。
- 遺傳學模型：生成Pramel15基因敲除小鼠模型，研究其在胚胎發(fā)育中的作用。
結(jié)果圖形
（1）篩選鑒定促進DNA去甲基化因子Pramel15，Pramel15過表達導(dǎo)致整體DNA去甲基化
圖1：Pramel15過表達導(dǎo)致整體DNA被動去甲基化。
a. B2-17細胞系（對DNA去甲基化敏感）方案。CMV啟動子驅(qū)動的GFP片段通過HapII體外甲基化，然后整合到HEK293細胞中。選擇低GFP背景和對5-氮雜-2'-脫氧胞苷高敏感的克隆作為B2-17。b. 左側(cè)熒光圖像顯示B2-17轉(zhuǎn)染Pramel15表達質(zhì)粒后GFP激活的細胞。右側(cè)條形圖顯示使用流式細胞排序（FACS）的B2-17轉(zhuǎn)染Pramel15表達質(zhì)粒后GFP陽性細胞比例。進行三次生物學重復(fù)。
c. BS-seq顯示B2-17細胞轉(zhuǎn)染Pramel15表達質(zhì)粒后CMV啟動子的DNA甲基化狀態(tài)。96小時后提取基因組DNA，然后進行CMV啟動子的亞硫酸鹽測序。
d. 條形圖顯示B2-17基因組中5-甲基胞嘧啶（mC）和5-羥甲基胞嘧啶（hmC）的相對水平。細胞在Pramel15表達后的1-4天收獲，提取基因組DNA進行核苷質(zhì)量譜分析。參照第0天細胞的5mC水平進行歸一化。
e. B2-17基因組DNA在轉(zhuǎn)染表達Pramel15-mCherry或mCherry的質(zhì)粒后提取進行核苷質(zhì)量譜分析。
（2）Pramel15與DNMT1 RFTS結(jié)構(gòu)域互作并調(diào)節(jié)DNMT1蛋白穩(wěn)定性
圖2：Pramel15與DNMT1互作，并通過泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)DNMT1降解。
b. 高含量圖像顯示有無Pramel15-mCherry誘導(dǎo)的DNMT1-GFP水平，通過多西環(huán)素（Dox）處理48小時（左），箱線圖顯示DMSO組（n=3973）和Dox組（n=3109）的統(tǒng)計結(jié)果（右）。
c. 在表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的T-REx293細胞中，DNMT1蛋白水平的Western Blot分析，
d. DNMT1及其截短體的示意圖。
e-f. 293FT細胞轉(zhuǎn)染DNMT1-Flag或其截短體和Pramel15-HA表達質(zhì)粒后的Flag免疫沉淀。
g. 293FT細胞中有無Pramel15-HA的Flag-DNMT1和Flag-DNMT1(Δ350-609aa)蛋白水平Western Blot分析。
h. 在表達Flag-DNMT1(350-609aa)和Dox誘導(dǎo)的Pramel15-HA的mES細胞中，F(xiàn)lag-DNMT1(350-609aa)蛋白水平的Western Blot分析。
i. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達His-ubiquitin、Flag-DNMT1(1-609aa)和Pramel15-HA或空質(zhì)粒，并用20μM MG132處理后的Flag免疫沉淀。所有通過Western Blot分析的免疫沉淀和定量實驗至少重復(fù)三次。
（3）Cullin-RING連接酶參與Pramel15介導(dǎo)的DNMT1降解
圖3：Cullin-RING E3泛素連接酶參與Pramel15介導(dǎo)的DNMT1降解。
b. 表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的mES細胞中，有或沒有 2.5 μM MLN4924處理的DNMT1蛋白水平的Western Blot分析。
c. 表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的mES細胞和Cul5-KO mES細胞中，DNMT1蛋白水平的Western Blot分析。
d. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達Pramel15-HA和不同F(xiàn)lag標記的Cullin蛋白質(zhì)粒后的Flag免疫沉淀。
e. Cullin-RING E3泛素連接酶復(fù)合體的模型。不同的Cullin復(fù)合體包含不同接頭，Cul5與Rbx2結(jié)合，而其他Cullin蛋白與Rbx1結(jié)合。
f. 表達Dox誘導(dǎo)的Pramel15-Flag的mES細胞和Cul5-KO mES細胞中，有或沒有Rbx1 siRNA轉(zhuǎn)染的DNMT1蛋白水平的Western Blot分析（左）。四個生物學重復(fù)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)（右）。
（4）Pramel15介導(dǎo)DNMT1降解的主要motifs
圖4：Pramel15的域結(jié)構(gòu)及其與Cul5和DNMT1的互作。
a. 示意圖展示Pramel15的域結(jié)構(gòu)，包含預(yù)測的BC-box、Cul2-box、Cul5-box和LRR（亮氨酸富集重復(fù)序列）motif（基序）。b. Pramel15與含有BC和Cul2 box或BC和Cul5 box motif的蛋白質(zhì)的多序列比對，突出顯示保守的殘基。黑色表示相同的氨基酸，非常相似-深灰色，相似-淺灰色。星號標記保守的Pramel15殘基。
c. 預(yù)測的Pramel15 LRR motif序列，LRR序列模式（LXXLXL）中保守的亮氨酸用黃色突出顯示。
d. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達Pramel15-HA和Flag標記的Cul5的質(zhì)粒后的HA免疫沉淀。Western blot顯示DNMT1和Cul5與Pramel15、Pramel15(Δ2-121aa)和Pramel15(Δ268-402aa)的關(guān)聯(lián)。
e. Pramel15在BC-box、Cul2-box和Cul5-box的點突變體表格。
f. Western blot顯示在293FT細胞中表達Dox誘導(dǎo)HA標記的Pramel15突變體（如e所示）的DNMT1蛋白水平。
g. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達HA標記的Pramel15或N端突變體和Flag標記的Cul5的質(zhì)粒后的Flag免疫沉淀。Western blot顯示Cul5與Pramel15及其突變體的關(guān)聯(lián)。
h. 在293FT細胞中表達Dox誘導(dǎo)的HA標記的LRR motif突變體（根據(jù)圖4c，L/V/F替換為A）的Pramel15的DNMT1蛋白水平的Western blot。
i. 293FT細胞轉(zhuǎn)染表達Flag標記的DNMT1和HA標記的Pramel15或LRRs突變體（根據(jù)c，L/V/F替換為A）的質(zhì)粒，并用2.5μM MLN4924處理以防止DNMT1降解后的Flag免疫沉淀。Western blotting顯示DNMT1與Pramel15及其LRRs突變體的關(guān)聯(lián)。
（5）Pramel15基因敲除小鼠沒有明顯的發(fā)育和生育缺陷，Pramel15調(diào)節(jié)早期胚胎細胞核中DNMT1蛋白水平
圖5：母源性Pramel15缺失增加了胚胎核中的DNMT1水平。
b. 通過顯微注射Pramel15-mCherry mRNA在GV期卵母細胞、合子（受精卵）和2C胚胎中Pramel15的定位代表性熒光圖像。三次重復(fù)。
c. 高含量成像分析系統(tǒng)獲取的圖像的3D重建示意圖。
d. 野生型（WT，n=118）和Pramel15基因敲除（KO，n=118）卵母細胞的受精卵核中相對DNMT1強度條形圖。
e. 雄性（WT，n=58；KO，n=56）和雌性（WT，n=57；KO，n=60）原核中相對DNMT1強度條形圖，原核根據(jù)核大小來定義。
f. 受精卵（合子）（WT，n=49；KO，n=45）、2細胞胚胎（2C）（WT，n=67；KO，n=57）、4細胞胚胎（4C）（WT，n=73；KO，n=71）、8細胞胚胎（8C）（WT，n=139；KO，n=124）和囊胚（WT，n=337；KO，n=185）核中相對DNMT1強度條形圖。DNMT1強度在每個階段都參照WT組進行歸一化。
g-h. 用DMSO（WT，n=107；KO，n=145）、MG132（WT，n=100；KO，n=127）和MLN4924（WT，n=126；KO，n=143）處理的受精卵（合子）核中相對DNMT1強度條形圖。合子在受精后2小時轉(zhuǎn)移到含有DMSO、10μM MG132和5μM MLN4924的HTF中，進一步培養(yǎng)額外的9小時。
i. 基因組被劃分為1Mb bins。歸一化DNMT1 CUT&RUN計數(shù)代表DNMT1水平。
j. 每個相應(yīng)基因組bins中DNMT1水平由歸一化計數(shù)表示。基因組 bins根據(jù)MII期卵母細胞中H3K9me3 ChIP-seq reads排序。H3K9me3 ChIP-seq數(shù)據(jù)來源：GSM2588560。
（6）Pramel15 缺失胚胎中 DNA 甲基化水平增加
圖6：母源性Pramel15缺失導(dǎo)致DNA甲基化水平增加。
a-c. WGBS揭示野生型（WT）或Pramel15雜合（Het）和Pramel15基因敲除（KO）卵母細胞的MII期卵母細胞、受精卵（合子）和2細胞胚胎的全基因組DNA甲基化水平。d.受精卵中父本和母本基因組的全基因組DNA甲基化水平，分別通過DBA/2J和C57BL/J的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）進行區(qū)分。
e. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖(parthenogenesis)1細胞胚胎的全基因組DNA甲基化水平。
f. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎之間1Mb bins的平均CpG甲基化差異箱線圖�；蚪Mbins根據(jù)DNMT1 CUT&RUN信號增加排序。
g. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎之間1Mb bins的平均CpG甲基化差異條形圖�；蚪Mbin根據(jù)MII期卵母細胞中H3K9me3 ChIP-seq reads排序。
h. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎中CpG甲基化和H3K9me3密度差異基因組瀏覽器視圖。H3K9me3 ChIP-seq數(shù)據(jù)來源：GSM2588560。
i. MII期卵母細胞中1kb bins的CpG甲基化變化和CpG數(shù)量相關(guān)性分析。
j. DNA復(fù)制過程中1kb bins的DNA甲基化維持效率，展示了復(fù)制耦合（0分鐘）和復(fù)制后5分鐘的情況。數(shù)據(jù)來源：GSE131098。
k. Pramel15 Het和KO卵母細胞孤雌生殖1細胞胚胎中1kb bins的平均CpG甲基化差異（mCG%KO− mCG%het），按MII期卵母細胞中1kb bins總甲基化CpG數(shù)量平均值排序。
易小結(jié)
本研究首先揭示了Pramel15通過Cullin-RING E3泛素連接酶復(fù)合體促進DNMT1降解。同時Pramel1的缺失導(dǎo)致受精卵細胞核中DNMT1水平升高，影響受精卵DNA去甲基化，并在早期胚胎中引起DNA甲基化水平的隨機增加。此外，Pramel15基因敲除小鼠表現(xiàn)顯著的DNA甲基化增加，但并未觀察到明顯的發(fā)育或生育缺陷。
研究結(jié)果表明Pramel15通過調(diào)節(jié)DNMT1在核內(nèi)的豐度，精細調(diào)控整體去甲基化過程，這對于早期胚胎的表觀遺傳重編程至關(guān)重要。
研究亮點
- 新的表觀遺傳調(diào)控機制：揭示了Pramel15在DNA去甲基化中的新作用，為理解哺乳動物DNA甲基化重編程提供了新的視角。
- 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)新功能：發(fā)現(xiàn)Pramel15通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)DNMT1的穩(wěn)定性，為DNA甲基化調(diào)控提示新機制。
- 胚胎發(fā)育新認識：研究結(jié)果為理解早期胚胎發(fā)育中的DNA甲基化動態(tài)變化提供了重要信息，可能對生殖生物學和再生醫(yī)學有重要意義。
圖7：受精卵DNA甲基化重編程參與機制模型。
為保護受精卵中DNA甲基化重編程，DNMT1和UHRF1受多層調(diào)控。NLRP14最近被鑒定為調(diào)控UHRF1細胞質(zhì)滯留因子，而DNMT1通過PADI6在細胞質(zhì)中受限。同時，DNMT1從細胞核中積極出核。但涉及DNMT1細胞核出核和細胞質(zhì)滯留因子仍然未知。在細胞核內(nèi)，TET3通過主動去甲基化某些區(qū)域參與DNA重編程。另一方面，在重編程過程中，某些區(qū)域的DNA甲基化得以保留，例如印記區(qū)域，這依賴于細胞核中的DNMT1/UHRF1。為了防止過量的DNMT1損害DNA去甲基化，Pramel15通過招募Cullin-RING E3泛素連接酶，靶向DNMT1通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）進行降解。參考文獻：Tan J, Li Y, Li X, Zhu X, Liu L, Huang H, Wei J, Wang H, Tian Y, Wang Z, Zhang Z, Zhu B. Pramel15 facilitates zygotic nuclear DNMT1 degradation and DNA demethylation. Nat Commun. 2024 Aug 25;15(1):7310. pii: 10.1038/s41467-024-51614-0. doi: 10.1038/s41467-024-51614-0. PubMed PMID: 39181896.
標簽：
DNA甲基化
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