大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。

豬作為主要的肉類來(lái)源和人類疾病的理想模型，其肌肉發(fā)育研究對(duì)于農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)都至關(guān)重要。商業(yè)品種（commercial breeds，瘦肉型）和本土品種（indigenous breeds，肥胖型）之間在肌肉生長(zhǎng)上存在顯著的表型差異，為鑒定肌肉發(fā)育中的關(guān)鍵基因和通路提供了絕佳模型。盡管已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)豬肌肉進(jìn)行了廣泛的測(cè)序研究，但針對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，尤其是表觀遺傳修飾的高通量測(cè)序研究仍然較少。m6A作為真核生物mRNA中最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾，幾乎調(diào)控mRNA代謝的所有方面，包括轉(zhuǎn)錄、pre-mRNA處理、翻譯和降解。m6A修飾由一組“writers”酶復(fù)合體催化，包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）、METTL14、Wilms腫瘤相關(guān)蛋白（WTAP）和ZC3H13。m6A修飾可以由“erasers”酶如FTO和ALKBH5動(dòng)態(tài)可逆。m6A修飾通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)mRNA翻譯。在mRNA穩(wěn)定性調(diào)控方面，m6A主要通過(guò)YTHDF2促進(jìn)mRNA降解。近期研究發(fā)現(xiàn)m6A的替代作用，即IGF2BP蛋白介導(dǎo)其增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性和保守功能。

近日，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所助理研究員顧浩博士為第一作者、湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/湖北省洪山實(shí)驗(yàn)室畢延震研究員和中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所印遇龍?jiān)菏繛楣餐�通訊在《cells》雜志發(fā)表了題為“N6-Methyladenosine RNA Modification Regulates the Differential Muscle Development in Large White and Ningxiang Pigs”的研究論文，研究了N6-甲基腺苷（m6A）RNA修飾在大約克豬（Large White, LW）和寧鄉(xiāng)豬（Ningxiang, NX）肌肉發(fā)育差異中的調(diào)控作用。研究通過(guò)MeRIP-seq技術(shù)揭示了m6A甲基化模式，并發(fā)現(xiàn)m6A修飾在肌肉細(xì)胞發(fā)育、肌原纖維、細(xì)胞周期和磷酸酶調(diào)節(jié)活性等方面對(duì)肌肉發(fā)育的新生兒階段具有調(diào)控作用。特別地，研究指出m6A修飾通過(guò)YTHDF2依賴性方式加速了特定肌肉特異性跨膜蛋白WFS1降解，并鑒定出一個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)C21551T，該位點(diǎn)在WFS1基因的最后一個(gè)外顯子中，導(dǎo)致LW和NX豬中WFS1表達(dá)水平的差異。
 

本研究鑒定了大約克豬（Large White, LW）和寧鄉(xiāng)豬（Ningxiang, NX）不同品種新生仔豬肌肉發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)基因，并通過(guò)MeRIP-seq繪制了m6A甲基化模式。研究結(jié)果表明，m6A修飾在肌肉發(fā)育的新生仔豬階段調(diào)控肌肉細(xì)胞發(fā)育、肌原纖維、細(xì)胞周期和磷酸酶調(diào)節(jié)活性。且LW和NX豬中差異表達(dá)基因主要富集在參與蛋白質(zhì)合成通路中。對(duì)MeRIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，共鑒定出27個(gè)差異表達(dá)且m6A修飾基因。還鑒定出一種典型的肌肉特異性包膜跨膜蛋白WFS1，在LW和NX豬中通過(guò)m6A修飾被差異調(diào)控，進(jìn)一步揭示了m6A修飾以YTHDF2依賴方式加速了WFS1降解。最后鑒定了WFS1最后一個(gè)外顯子中的C21551T導(dǎo)致m6A甲基化變化，從而影響LW和NX豬中的WFS1表達(dá)水平差異。本研究對(duì)NX和LW豬在新生仔豬肌肉發(fā)育期間的m6A修飾進(jìn)行了全面分析，并闡明了m6A修飾對(duì)這兩個(gè)品種WFS1差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

圖1：5日齡NX豬和LW豬背最長(zhǎng)肌特征。

圖2：m6A修飾參與調(diào)控肌肉發(fā)育。

1. qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NX和LW豬肌肉中與m6A相關(guān)基因的表達(dá)水平。
2. 代表性NX和LW豬背最長(zhǎng)肌切片中FTO（綠色）圖像；DAPI用于核染色（藍(lán)色）。
3. Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在LW豬肌肉中FTO表達(dá)水平升高，METTL4表達(dá)水平降低。
4. 使用ImageJ軟件對(duì)m6A水平進(jìn)行定量分析。
5. Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在分化后第0、2和4天，豬衛(wèi)星細(xì)胞（PSCs）中FTO蛋白表達(dá)顯著增加。
6. Myhc免疫熒光染色顯示，F(xiàn)TO過(guò)表達(dá)顯著增加了Myhc+細(xì)胞比例，而FTO敲低顯著減少了Myhc+細(xì)胞的比例（n = 3）。* p < 0.05，** p < 0.01。

圖3：mRNA m6A甲基化在LW和NX豬肌肉中的整體特征。

1. 檢測(cè)NX和LW豬肌肉中m6A修飾工作流程。通過(guò)免疫沉淀(IP)純化含m6A的mRNA片段。
2. 每組m6A peaks的平均數(shù)量。
3. 沿轉(zhuǎn)錄本的m6A peaks密度。
4. LW和NX豬肌肉中m6A富集的共有motifs。
5. NX-1豬染色體上m6A富集區(qū)域分布。

F-G. (F) GO和(G) KEGG富集分析，在NX-1豬肌肉樣本中有2035個(gè)基因發(fā)生m6A修飾。

圖4：LW和NX豬肌肉之間差異性m6A修飾的比較。

1. LW和NX豬肌肉之間差異性m6A修飾基因火山圖
2. 染色體上富集區(qū)域中差異性m6A修飾基因分布。

C-D. mRNA區(qū)域中顯著差異m6A peaks分布。

E. KEGG富集分析顯示LW與NX豬肌肉中差異性上調(diào)的m6A修飾基因。

F. KEGG富集分析顯示LW與NX豬肌肉中差異性下調(diào)的m6A修飾基因。

圖5：LW和NX豬骨骼肌的mRNA中差異表達(dá)水平。

1. 差異表達(dá)的mRNA基因火山圖。
2. 差異表達(dá)的mRNA基因分層聚類分析。
3. qPCR結(jié)果顯示LW豬中上調(diào)的mRNA表達(dá)。
4. qPCR結(jié)果顯示LW豬中下調(diào)的mRNA表達(dá)。
5. 通過(guò)GO分析富集的前30個(gè)差異表達(dá)基因通路。
6. 通過(guò)KEGG預(yù)測(cè)富集的前30個(gè)差異表達(dá)基因通路。* p < 0.05，** p < 0.01。

圖6：RNA-Seq和MeRIP-Seq的綜合分析。

1. 差異性m6A甲基化和mRNA表達(dá)變化的peaks數(shù)量韋恩圖。
2. 四象限圖展示基因分布情況。不同顏色表示RNA表達(dá)或m6A甲基化水平不同變化。
3. 熱圖顯示了27個(gè)甲基化水平有顯著差異基因的表達(dá)情況。
4. IgG作為陰性對(duì)照，通過(guò)MeRIP-qPCR驗(yàn)證5個(gè)m6A甲基化基因。
5. qPCR分析顯示，與NX豬相比，LW豬中5個(gè)高表達(dá)上調(diào)基因的表達(dá)增加。
6. 在SH3BP4基因位點(diǎn)上，IGV可視化顯示RNA-seq（灰色）數(shù)據(jù)和MeRIP-seq（紅色和藍(lán)色）數(shù)據(jù)。

圖7：m6A修飾調(diào)控NX和LW豬肌肉中WFS1的差異表達(dá)。

1. 基因組瀏覽器軌跡顯示W(wǎng)FS1基因位點(diǎn)的RNA-seq（灰色）和MeRIP-seq（藍(lán)色和綠色）數(shù)據(jù)。
2. MeRIP-qPCR驗(yàn)證WFS1的m6A修飾。IgG作為陰性對(duì)照。
3. 檢測(cè)LW和NX豬肌肉中WFS1的表達(dá)。
4. 用FB23-2或DMSO處理的PSCs中WFS1 mRNA表達(dá)的RT-PCR分析。
5. 檢測(cè)用FB23-2或DMSO處理的PSCs中WFS1 mRNA降解率。
6. 在干擾YTHDF2后，檢測(cè)DMSO和FB23-2處理組中WFS1的表達(dá)。
7. 兩個(gè)品種仔豬共6個(gè)樣本在m6A結(jié)合peaks序列和SNP位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果。
8. m6A結(jié)合peaks的SNP位點(diǎn)的雙熒光檢測(cè)。包含C或T的結(jié)合片段被克隆到pmirGLO質(zhì)粒中，分別命名為pmirGLO-MutC和pmirGLO-MutT（上圖）。然后，它們與陰性對(duì)照空載體（pmirGLO-WT）一起轉(zhuǎn)染入PSCs，隨后用FB23-2處理（紅色+/−）。