RRBS等揭示IDH1-R132H突變通過DNA甲基化加劇順鉑誘導腎毒性
順鉑（cisplatin）是一種廣泛使用的化療藥物，但其使用常伴隨著包括腎毒性在內的多種副作用。急性腎損傷 （Acute kidney injury，AKI）是與順鉑治療相關的最常見不良反應之一,約30%患者因順鉑的腎毒性而中斷治療。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）的亞型IDH1在維持細胞氧化狀態(tài)的氧化還原平衡中起著重要作用，IDH1-R132H突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，但順鉑是否會在攜帶IDH1-R132H突變的個體中引起更嚴重的腎毒性尚不清楚。深入探究順鉑誘導的腎毒性機制，并研究IDH1-R132H突變是否通過影響線粒體氧化應激加劇順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷，從而促進順鉑誘導的急性腎損傷（Cis-AKI）發(fā)生機制至關重要。
近日，福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科賴坤美博士等為第一作者，福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科許艷芳教授和中國香港科學園腫瘤學及免疫學中心Tak W. Mak為共同通訊，在Nature子刊《Cell Death & Differentiation》(中科院1區(qū)top)發(fā)表了題為“The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction”的合作研究成果，研究通過RRBS等分析揭示了IDH1-R132H突變通過破壞NDUFA1和FSP1相互作用促進鐵死亡，從而加重順鉑誘導的急性腎損傷，詳細探討了IDH1-R132H突變在順鉑化療中對腎臟毒性的影響，并揭示了其潛在的分子機制。
標題：The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction（IDH1-R132H 突變通過破壞 NDUFA1 和 FSP1 互作促進鐵死亡，從而加劇順鉑誘導的急性腎損傷）
發(fā)表時間：2024年9月22日
發(fā)表期刊：Cell Death & Differentiation
影響因子：IF 13.7/1區(qū)
技術平臺：RRBS、RNA-seq（易基因金牌技術）
本研究結果揭示IDH1-R132H突變加劇了腎小管中線粒體脂質過氧化和功能障礙，使腎臟更容易受到順鉑誘導的鐵死亡影響。IDH1-R132H突變增加Ndufa1啟動子甲基化，從而抑制NDUFA1的轉錄和翻譯。這種抑制破壞了NDUFA1與FSP1的相互作用，降低了其對順鉑誘導的腎小管上皮細胞死亡的抵抗力。進而導致活性氧（ROS）積累、脂質過氧化發(fā)生，促進鐵死亡，從而引發(fā)急性腎損傷。總之，這項研究闡明了順鉑誘導的腎毒性新機制，并為攜帶IDH1-R132H突變的腫瘤患者個性化治療策略發(fā)展提供了寶貴見解。
研究方法
1. 動物模型建立：使用特異性突變的IDH1在腎小管中（Idh1WT/WTKspCre）的小鼠模型，與Idh1WT/WTKspCre組進行比較，通過腹腔注射順鉑建立Cis-AKI模型。
2. 細胞活性和細胞死亡評估：評估順鉑處理后腎小管上皮細胞（PTCs）的活性和死亡。
3. 氧化應激和線粒體ROS的測量：使用DCFH-DA和MitoSOX等熒光探針檢測細胞內ROS和線粒體ROS。
4. 脂質過氧化、線粒體形態(tài)和線粒體膜電位（MMP）檢測：評估順鉑處理后腎臟組織的脂質過氧化水平和線粒體功能。
5. 免疫共沉淀和鄰位連接（PLA）實驗：分析NDUFA1和FSP1之間的直接相互作用。
6. CRISPR-Cas9技術：敲除Ndufa1和Fsp1基因以研究其在順鉑誘導的細胞死亡中的作用。
7. 簡化基因組甲基化測序（RRBS）和轉錄組測序（RNA-seq）：用于分析IDH1-R132H突變對腎臟DNA甲基化模式和基因表達的影響。
結果圖形
（1）腎小管中的IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導的腎功能障礙
圖1：IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導的小鼠腎功能不全。
A-B. 檢測順鉑給藥后0小時、24小時、48小時和72小時的血尿素氮（BUN）（A）和血清肌酐（Scr）水平（B）。結果顯示Idh1WT/MutKspCre小鼠的Scr和BUN水平高于Idh1WT/WTKspCre組。
C-F. 在腹腔注射10 mg/kg順鉑前1天和2小時預先使用鐵死亡抑制劑Lip-1進行預處理。觀察0小時、24小時、48小時和72小時BUN和肌酐水平的變化。
G-H. 腹腔注射10 mg/kg順鉑3天后的PAS染色腎臟切片代表性圖像，H對G腎臟損傷結果定量分析。
（2）IDH1-R132H 突變加重順鉑誘導的氧化應激和近端腎小管上皮細胞鐵死亡
C-D. 對腹腔注射10 mg/kg順鉑3天的腎臟進行4HNE（紅色）和DAPI（藍色）的免疫熒光染色，隨后對4HNE陽性細胞進行定量分析。
E. 在腹腔注射10 mg/kg順鉑3天后對腎臟中丙二醛（MDA）含量進行定量分析。
F. 從腎臟中提取新鮮的近曲小管進行western blot分析，重點關注鐵死亡和抗氧化信號分子表達。
（3）IDH1-R132H 突變通過促進線粒體功能障礙誘導鐵死亡
B-C. 將（A）中的TECs接種在12孔培養(yǎng)板中。接種后第10天進行集落計數(shù)分析。使用CCK-8實驗（C）測量細胞增殖。
D–I. 從Idh1WT/WTKspCre組和Idh1WT/MutKspCre小鼠中分離出PTCs進行分析。（D）代表性的PI染色圖像顯示順鉑誘導的PTCs細胞死亡。（E）使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。（F）在順鉑處理24小時后， Mitotracker和MitoSOX探針對細胞染色。（G）使用DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測順鉑誘導的Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut PTCs的ROS產生，隨后進行流式細胞分析。（H）使用JC-10染色方法測量順鉑處理后Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut細胞的線粒體膜電位（MMP）。結果表明IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導的PTCs MMP的降低。（I）定量分析紅色聚集體與綠色單體比例。
（4）IDH1-R132H突變通過上調Ndufa1啟動子甲基化水平抑制Ndufa1表達
IDH1-R132H突變主要通過改變表觀遺傳調控機制來影響細胞功能。作者假設腎小管中的IDH1-R132H突變可能會改變與線粒體相關基因的甲基化模式，從而加劇順鉑誘導的腎臟損傷。RRBS測序分析結果揭示在Idh1WT/MutKspCre小鼠腎臟的外顯子區(qū)域有15296個上調和7947個下調的差異甲基化基因，而在啟動子區(qū)域觀察到12935個上調和4409個下調的差異甲基化基因（以Idh1WT/WTKspCre小鼠作為對照組）（附圖）。基因富集分析表明啟動子區(qū)域與組蛋白乙�；�、細胞代謝和氧化磷酸化相關的信號被激活（圖4A）。在上調的甲基化位點中，與線粒體呼吸鏈組裝相關基因Ndufa1的啟動子區(qū)域觀察到顯著增強的甲基化。進一步的亞硫酸鹽測序PCR（BSP）結果與RRBS測序一致。Ndufa1啟動子差異甲基化區(qū)域位于chrX:37191032-37191910區(qū)域，包含74個CpG位點。在體外實驗中，Idh1WT/WT組中Ndufa1區(qū)域的CpG位點約有47.4%被甲基化，而在Idh1WT/Mut組中，約有82.4%的CpG位點被甲基化（圖4B）。在Idh1WT/WTKspCre小鼠的腎臟組織中，Ndufa1區(qū)域約有54%的CpG位點甲基化，而在Idh1WT/MutKspCre組中，約有80%的CpG位點甲基化。腎臟組織和體外PTCs的QT-PCR和western blot分析表明NDUFA1的表達水平降低（圖4C、D）。為了測試CpG甲基化是否在Ndufa1基因轉錄抑制中起直接作用，作者進行了MSssI的補丁甲基化實驗，并結合熒光素酶活性檢測。分析結果表明CpG甲基化抑制了Ndufa1基因啟動子活性，并在沉默Ndufa1中起直接作用。CpG位點甲基化由IDH1-R132H調控。這些結果強調了由于IDH1-R132H突變引起的甲基化水平上調，導致Ndufa1的轉錄和翻譯抑制。
B-C. Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut組在CpG島和DNA啟動子區(qū)域的CG、CHG和CHH的甲基化率。mCG、mCHG和mCHH分別代表CG、CHG和CHH的甲基化形式。
D-E. 基因元件和染色體上差異甲基化位點分布。
F-G. 基因元件甲基化水平分布。
CGI：CpG島。downshelf：CpG島上游2-4kb。downshore：CpG島上游2kb。upshelf：CpG島上游2-4kb。upshore：CpG島上游2kb。up2k：基因轉錄起始位點上游2kb。genebody：基因體區(qū)域。down2k：基因下游2Kb。
B. BSP驗證。每個圓圈代表一個CpG位點，●表示甲基化位點，○表示未甲基化位點。
C-D. 在從Idh1WT/WTKspCre組和Idh1WT/MutKspCre小鼠分離的PTCs中，通過RT-PCR定量和WB分析NDUFA1相對于β-actin的表達。n=6，****P<0.0001。
E. 使用MSssI處理和熒光素酶活性組合來確定CpG甲基化是否直接促進Ndufa1基因轉錄抑制。與對照細胞（未用MSssI處理的片段）相比，含有Ndufa1啟動子報告基因構建的293T細胞經MssI處理后熒光素酶活性顯著下調，
F. 當IDH-R132H過表達質�；驅φ张cpGL4-Ndufa1和Renilla熒光素酶載體共轉染入293T細胞時，與Idh1WT/WT組相比，Idh1WT/Mut組熒光素酶活性降低。
（5）NDUFA1參與IDH1-R132H突變型腎小管上皮細胞中順鉑誘導的線粒體功能障礙和氧化應激
B. 使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
C. 通過Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示NDUFA1過表達減輕了順鉑誘導的IDH1-R132H突變腎小管上皮細胞的線粒體功能障礙。
D. 使用MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針分別檢測感染空載體（vector）或Flag-NDUFA1慢病毒的Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut PTCs的MitoROS生成、ROS產生和脂質ROS水平，并通過FACS進行分析。
E. 代表性PI染色圖像顯示Ndufa1和Ndufa1+/+-/- HK-2細胞受順鉑誘導死亡。
F. PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
G. 通過Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示Ndufa1缺失加劇順鉑誘導的腎小管上皮細胞的線粒體功能障礙。
H. MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測Ndufa1和Ndufa1+/+-/-腎小管細胞的MitoROS生成、ROS產生和脂質ROS水平，顯示Ndufa1缺失加劇了順鉑誘導的腎小管損傷。
（6）NDUFA1 通過與 FSP1 相互作用抑制線粒體氧化應激
B. 鄰近連接分析（PLA）檢測了順鉑處理24小時后腎小管上皮細胞中FSP1和NDUFA1之間的物理相互作用。紅色點表示PLA陽性信號。細胞核用Hoechst染色進行反向染色。
C. 使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察順鉑處理24小時后腎小管上皮細胞中FSP1和NDUFA1的共定位。
D. 從Idh1WT/WTKspCre和Idh1WT/MutKspCre小鼠中分離出PTCs，PTCs感染空載體或Flag-Fsp1慢病毒后，加入25 μm順鉑。代表性PI染色圖像顯示順鉑誘導PTC死亡。
E. 使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
F. Mitotracker和MitoSOX探針染色PTCs。
G. 在PTCs中使用MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測ROS產生和脂質ROS水平。
B. PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
C. 通過Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示Fsp1缺失加劇了順鉑誘導的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙
D. 在Fsp1和Fsp1+/+-/-細胞中使用MitoSox、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測ROS產生和脂質ROS水平，顯示Fsp1缺失加劇了順鉑誘導的腎小管損傷。
E. IDH1-R132H加劇順鉑誘導的急性腎損傷（Cis-AKI）機制示意圖。
易小結
本研究結果表明IDH1-R132H突變通過增加Ndufa1啟動子甲基化，抑制NDUFA1轉錄和表達，破壞NDUFA1與FSP1互作，從而影響FSP1在線粒體中的定位及其將CoQ還原為CoQH2的能力，導致ROS和脂質過氧化物積累，進而加劇順鉑誘導的氧化損傷和鐵死亡在腎小管上皮細胞中的發(fā)生。
研究亮點
Lai K, Chen Z, Lin S, Ye K, Yuan Y, Li G, Song Y, Ma H, Mak TW, Xu Y. The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction. Cell Death Differ. 2024 Sep 22. pii: 10.1038/s41418-024-01381-8. doi: 10.1038/s41418-024-01381-8. PubMed PMID: 39306640.
近日，福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科賴坤美博士等為第一作者，福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科許艷芳教授和中國香港科學園腫瘤學及免疫學中心Tak W. Mak為共同通訊，在Nature子刊《Cell Death & Differentiation》(中科院1區(qū)top)發(fā)表了題為“The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction”的合作研究成果，研究通過RRBS等分析揭示了IDH1-R132H突變通過破壞NDUFA1和FSP1相互作用促進鐵死亡，從而加重順鉑誘導的急性腎損傷，詳細探討了IDH1-R132H突變在順鉑化療中對腎臟毒性的影響，并揭示了其潛在的分子機制。
標題：The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction（IDH1-R132H 突變通過破壞 NDUFA1 和 FSP1 互作促進鐵死亡，從而加劇順鉑誘導的急性腎損傷）
發(fā)表時間：2024年9月22日
發(fā)表期刊：Cell Death & Differentiation
影響因子：IF 13.7/1區(qū)
技術平臺：RRBS、RNA-seq（易基因金牌技術）
本研究結果揭示IDH1-R132H突變加劇了腎小管中線粒體脂質過氧化和功能障礙，使腎臟更容易受到順鉑誘導的鐵死亡影響。IDH1-R132H突變增加Ndufa1啟動子甲基化，從而抑制NDUFA1的轉錄和翻譯。這種抑制破壞了NDUFA1與FSP1的相互作用，降低了其對順鉑誘導的腎小管上皮細胞死亡的抵抗力。進而導致活性氧（ROS）積累、脂質過氧化發(fā)生，促進鐵死亡，從而引發(fā)急性腎損傷。總之，這項研究闡明了順鉑誘導的腎毒性新機制，并為攜帶IDH1-R132H突變的腫瘤患者個性化治療策略發(fā)展提供了寶貴見解。
研究方法
1. 動物模型建立：使用特異性突變的IDH1在腎小管中（Idh1WT/WTKspCre）的小鼠模型，與Idh1WT/WTKspCre組進行比較，通過腹腔注射順鉑建立Cis-AKI模型。
2. 細胞活性和細胞死亡評估：評估順鉑處理后腎小管上皮細胞（PTCs）的活性和死亡。
3. 氧化應激和線粒體ROS的測量：使用DCFH-DA和MitoSOX等熒光探針檢測細胞內ROS和線粒體ROS。
4. 脂質過氧化、線粒體形態(tài)和線粒體膜電位（MMP）檢測：評估順鉑處理后腎臟組織的脂質過氧化水平和線粒體功能。
5. 免疫共沉淀和鄰位連接（PLA）實驗：分析NDUFA1和FSP1之間的直接相互作用。
6. CRISPR-Cas9技術：敲除Ndufa1和Fsp1基因以研究其在順鉑誘導的細胞死亡中的作用。
7. 簡化基因組甲基化測序（RRBS）和轉錄組測序（RNA-seq）：用于分析IDH1-R132H突變對腎臟DNA甲基化模式和基因表達的影響。
結果圖形
（1）腎小管中的IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導的腎功能障礙
圖1：IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導的小鼠腎功能不全。
C-F. 在腹腔注射10 mg/kg順鉑前1天和2小時預先使用鐵死亡抑制劑Lip-1進行預處理。觀察0小時、24小時、48小時和72小時BUN和肌酐水平的變化。
G-H. 腹腔注射10 mg/kg順鉑3天后的PAS染色腎臟切片代表性圖像，H對G腎臟損傷結果定量分析。
（2）IDH1-R132H 突變加重順鉑誘導的氧化應激和近端腎小管上皮細胞鐵死亡
圖2：IDH1-R132H突變加劇順鉑誘導的氧化應激和腎小管上皮細胞鐵死亡。
A-B. 對腎臟中TUNEL的定量分析和代表性染色圖像。Idh1WT/MutKspCre組中TUNEL陽性的腎小管上皮細胞（proximal tubular epithelial cells，PTCs）數(shù)量高于Idh1WT/WTKspCre組。C-D. 對腹腔注射10 mg/kg順鉑3天的腎臟進行4HNE（紅色）和DAPI（藍色）的免疫熒光染色，隨后對4HNE陽性細胞進行定量分析。
E. 在腹腔注射10 mg/kg順鉑3天后對腎臟中丙二醛（MDA）含量進行定量分析。
F. 從腎臟中提取新鮮的近曲小管進行western blot分析，重點關注鐵死亡和抗氧化信號分子表達。
（3）IDH1-R132H 突變通過促進線粒體功能障礙誘導鐵死亡
圖3：IDH1-R132H突變通過促進線粒體功能障礙來誘導鐵死亡。
A. 腎小管上皮細胞（TECs，細胞系）被感染帶有Flag-IDH1-WT和Flag-IDH1-R132H編碼的慢病毒36小時，隨后用25μm順鉑刺激24小時。感染后36小時進行western blot檢測IDH1表達。B-C. 將（A）中的TECs接種在12孔培養(yǎng)板中。接種后第10天進行集落計數(shù)分析。使用CCK-8實驗（C）測量細胞增殖。
D–I. 從Idh1WT/WTKspCre組和Idh1WT/MutKspCre小鼠中分離出PTCs進行分析。（D）代表性的PI染色圖像顯示順鉑誘導的PTCs細胞死亡。（E）使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。（F）在順鉑處理24小時后， Mitotracker和MitoSOX探針對細胞染色。（G）使用DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測順鉑誘導的Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut PTCs的ROS產生，隨后進行流式細胞分析。（H）使用JC-10染色方法測量順鉑處理后Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut細胞的線粒體膜電位（MMP）。結果表明IDH1-R132H突變加劇了順鉑誘導的PTCs MMP的降低。（I）定量分析紅色聚集體與綠色單體比例。
（4）IDH1-R132H突變通過上調Ndufa1啟動子甲基化水平抑制Ndufa1表達
IDH1-R132H突變主要通過改變表觀遺傳調控機制來影響細胞功能。作者假設腎小管中的IDH1-R132H突變可能會改變與線粒體相關基因的甲基化模式，從而加劇順鉑誘導的腎臟損傷。RRBS測序分析結果揭示在Idh1WT/MutKspCre小鼠腎臟的外顯子區(qū)域有15296個上調和7947個下調的差異甲基化基因，而在啟動子區(qū)域觀察到12935個上調和4409個下調的差異甲基化基因（以Idh1WT/WTKspCre小鼠作為對照組）（附圖）。基因富集分析表明啟動子區(qū)域與組蛋白乙�；�、細胞代謝和氧化磷酸化相關的信號被激活（圖4A）。在上調的甲基化位點中，與線粒體呼吸鏈組裝相關基因Ndufa1的啟動子區(qū)域觀察到顯著增強的甲基化。進一步的亞硫酸鹽測序PCR（BSP）結果與RRBS測序一致。Ndufa1啟動子差異甲基化區(qū)域位于chrX:37191032-37191910區(qū)域，包含74個CpG位點。在體外實驗中，Idh1WT/WT組中Ndufa1區(qū)域的CpG位點約有47.4%被甲基化，而在Idh1WT/Mut組中，約有82.4%的CpG位點被甲基化（圖4B）。在Idh1WT/WTKspCre小鼠的腎臟組織中，Ndufa1區(qū)域約有54%的CpG位點甲基化，而在Idh1WT/MutKspCre組中，約有80%的CpG位點甲基化。腎臟組織和體外PTCs的QT-PCR和western blot分析表明NDUFA1的表達水平降低（圖4C、D）。為了測試CpG甲基化是否在Ndufa1基因轉錄抑制中起直接作用，作者進行了MSssI的補丁甲基化實驗，并結合熒光素酶活性檢測。分析結果表明CpG甲基化抑制了Ndufa1基因啟動子活性，并在沉默Ndufa1中起直接作用。CpG位點甲基化由IDH1-R132H調控。這些結果強調了由于IDH1-R132H突變引起的甲基化水平上調，導致Ndufa1的轉錄和翻譯抑制。
附圖：RBBS質控。
A. RBBS測序的六個樣本甲基化水平分布特征，不同樣本中CG、CHG和CHH甲基化位點一致分布。B-C. Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut組在CpG島和DNA啟動子區(qū)域的CG、CHG和CHH的甲基化率。mCG、mCHG和mCHH分別代表CG、CHG和CHH的甲基化形式。
D-E. 基因元件和染色體上差異甲基化位點分布。
F-G. 基因元件甲基化水平分布。
CGI：CpG島。downshelf：CpG島上游2-4kb。downshore：CpG島上游2kb。upshelf：CpG島上游2-4kb。upshore：CpG島上游2kb。up2k：基因轉錄起始位點上游2kb。genebody：基因體區(qū)域。down2k：基因下游2Kb。
圖4：IDH1-R132H突變顯著增強了Ndufa1啟動子的甲基化修飾水平。
A. RRBS測序對差異上調啟動子區(qū)域基因進行GO富集分析，展示最顯著GO富集的生物學過程。B. BSP驗證。每個圓圈代表一個CpG位點，●表示甲基化位點，○表示未甲基化位點。
C-D. 在從Idh1WT/WTKspCre組和Idh1WT/MutKspCre小鼠分離的PTCs中，通過RT-PCR定量和WB分析NDUFA1相對于β-actin的表達。n=6，****P<0.0001。
E. 使用MSssI處理和熒光素酶活性組合來確定CpG甲基化是否直接促進Ndufa1基因轉錄抑制。與對照細胞（未用MSssI處理的片段）相比，含有Ndufa1啟動子報告基因構建的293T細胞經MssI處理后熒光素酶活性顯著下調，
F. 當IDH-R132H過表達質�；驅φ张cpGL4-Ndufa1和Renilla熒光素酶載體共轉染入293T細胞時，與Idh1WT/WT組相比，Idh1WT/Mut組熒光素酶活性降低。
（5）NDUFA1參與IDH1-R132H突變型腎小管上皮細胞中順鉑誘導的線粒體功能障礙和氧化應激
圖5：NDUFA1在IDH1-R132H突變的腎小管上皮細胞中參與順鉑誘導的線粒體功能障礙和氧化應激。
A. 代表性PI染色圖像描述Idh1WT/WTKspCre和Idh1WT/MutKspCre小鼠中分離順鉑誘導的PTCs細胞死亡。B. 使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
C. 通過Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示NDUFA1過表達減輕了順鉑誘導的IDH1-R132H突變腎小管上皮細胞的線粒體功能障礙。
D. 使用MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針分別檢測感染空載體（vector）或Flag-NDUFA1慢病毒的Idh1WT/WT和Idh1WT/Mut PTCs的MitoROS生成、ROS產生和脂質ROS水平，并通過FACS進行分析。
E. 代表性PI染色圖像顯示Ndufa1和Ndufa1+/+-/- HK-2細胞受順鉑誘導死亡。
F. PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
G. 通過Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示Ndufa1缺失加劇順鉑誘導的腎小管上皮細胞的線粒體功能障礙。
H. MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測Ndufa1和Ndufa1+/+-/-腎小管細胞的MitoROS生成、ROS產生和脂質ROS水平，顯示Ndufa1缺失加劇了順鉑誘導的腎小管損傷。
（6）NDUFA1 通過與 FSP1 相互作用抑制線粒體氧化應激
圖6：NDUFA1通過調節(jié)FSP1來調控順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷。
A. 免疫共沉淀驗證NDUFA1和FSP1之間的直接互作。HEK293T細胞被共轉染帶有Flag-FSP1和HA-NDUFA1的質粒，隨后使用抗Flag M2磁珠進行免疫共沉淀以拉下Flag-FSP1。結果表明NDUFA1和FSP1之間存在直接互作。B. 鄰近連接分析（PLA）檢測了順鉑處理24小時后腎小管上皮細胞中FSP1和NDUFA1之間的物理相互作用。紅色點表示PLA陽性信號。細胞核用Hoechst染色進行反向染色。
C. 使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察順鉑處理24小時后腎小管上皮細胞中FSP1和NDUFA1的共定位。
D. 從Idh1WT/WTKspCre和Idh1WT/MutKspCre小鼠中分離出PTCs，PTCs感染空載體或Flag-Fsp1慢病毒后，加入25 μm順鉑。代表性PI染色圖像顯示順鉑誘導PTC死亡。
E. 使用PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
F. Mitotracker和MitoSOX探針染色PTCs。
G. 在PTCs中使用MitoSOX、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測ROS產生和脂質ROS水平。
圖7：Fsp1缺失增強了順鉑誘導的鐵死亡和氧化應激在腎小管上皮細胞中的作用。
A. 代表性PI染色圖像顯示Fsp1和Fsp1+/+-/-小鼠腎小管上皮細胞（TEC）被順鉑誘導的死亡。B. PI/Hoechst染色和Image J軟件量化細胞死亡。
C. 通過Mito-tracker染色觀察順鉑刺激后的線粒體形態(tài)，顯示Fsp1缺失加劇了順鉑誘導的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙
D. 在Fsp1和Fsp1+/+-/-細胞中使用MitoSox、DCFH-DA和C11-BODIPY探針檢測ROS產生和脂質ROS水平，顯示Fsp1缺失加劇了順鉑誘導的腎小管損傷。
E. IDH1-R132H加劇順鉑誘導的急性腎損傷（Cis-AKI）機制示意圖。
易小結
本研究結果表明IDH1-R132H突變通過增加Ndufa1啟動子甲基化，抑制NDUFA1轉錄和表達，破壞NDUFA1與FSP1互作，從而影響FSP1在線粒體中的定位及其將CoQ還原為CoQH2的能力，導致ROS和脂質過氧化物積累，進而加劇順鉑誘導的氧化損傷和鐵死亡在腎小管上皮細胞中的發(fā)生。
研究亮點
- 揭示鐵死亡和氧化應激的關聯(lián)：研究強調了鐵死亡在順鉑誘導的腎臟損傷中的作用，并揭示了NDUFA1-FSP1軸在調節(jié)氧化應激中的重要性。
- 提示新分子機制：本研究揭示了IDH1-R132H突變通過表觀遺傳機制影響線粒體功能，進而影響腎臟對順鉑的響應。
- 提供個性化治療策略：研究結果為攜帶IDH1-R132H突變的腫瘤患者提供了個性化治療策略的寶貴見解。
Lai K, Chen Z, Lin S, Ye K, Yuan Y, Li G, Song Y, Ma H, Mak TW, Xu Y. The IDH1-R132H mutation aggravates cisplatin-induced acute kidney injury by promoting ferroptosis through disrupting NDUFA1 and FSP1 interaction. Cell Death Differ. 2024 Sep 22. pii: 10.1038/s41418-024-01381-8. doi: 10.1038/s41418-024-01381-8. PubMed PMID: 39306640.
標簽：
DNA甲基化
