雙特異性抗體（Bispecific Antibody, BsAb）是一種通過基因重組技術(shù)創(chuàng)造的人工抗體，具備同時(shí)特異性地靶向并結(jié)合兩個(gè)不同抗原或抗原表位的能力。

憑借其獨(dú)特的特異性和雙功能性特點(diǎn)，BsAb類藥物已成為生物制藥研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)，特別是在腫瘤治療、炎癥性疾病及自身免疫性疾病等多個(gè)醫(yī)療領(lǐng)域，展現(xiàn)出了極為廣闊的應(yīng)用潛力和前景。

雙特異性抗體（BsAbs）的眾多下游工藝開發(fā)策略，很大程度上借鑒并擴(kuò)展了單克隆抗體（mAbs）已經(jīng)確立的純化方法。這一做法的合理性在于，BsAbs與mAbs之間確實(shí)存在著若干結(jié)構(gòu)上的共通之處，使得mAbs的優(yōu)化純化流程成為探索BsAbs純化工藝的理想起點(diǎn)。

Fig.1 免疫球蛋白G（IgG）單克隆抗體（mAb）以及主要的親和配體結(jié)合位點(diǎn)示意圖

Fig.1清晰地描繪了免疫球蛋白G（IgG）型單克隆抗體（mAb）的結(jié)構(gòu)組成。該抗體由兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）相互交織而成。

具體來說，重鏈（HC）包含了可變重鏈區(qū)（VH）、恒定區(qū)1（CH1）、鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)2（CH2）以及恒定區(qū)3（CH3）等多個(gè)結(jié)構(gòu)域；而輕鏈（LC）則包括可變輕鏈區(qū)（VL）和恒定輕鏈區(qū)（CL）。其中，VL與VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)形成抗體的可變片段（Fv），而VL、VH、CL與CH1結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成了抗原結(jié)合片段（Fab），這是抗體與抗原相互識(shí)別的關(guān)鍵區(qū)域。另一方面，CH2與CH3結(jié)構(gòu)域則聯(lián)合組成了抗體的可結(jié)晶片段（Fc）區(qū)域。該區(qū)域負(fù)責(zé)抗體的效應(yīng)功能，如與免疫細(xì)胞或補(bǔ)體系統(tǒng)的相互作用。

Fig.1還特別指出了IgG分子上主要的親和配體結(jié)合位點(diǎn)。這些位點(diǎn)以箭頭的形式標(biāo)記，是設(shè)計(jì)純化策略時(shí)需要重點(diǎn)考慮的因素。通過對(duì)這些結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)和結(jié)合位點(diǎn)的了解，研究人員能夠更有效地開發(fā)出針對(duì)BsAbs的純化工藝，從而實(shí)現(xiàn)高效、高純度的抗體生產(chǎn)。

根據(jù)BsAb的結(jié)構(gòu)，主要可以將其分為三大類，即（i）非對(duì)稱型，（ii）對(duì)稱型和（iii）基于片段的BsAbs。它們的結(jié)構(gòu)特性對(duì)它們的下游純化策略具有重要意義^[1]。其分類主要基于Fig.2展示的三種主要形式：

（i）非對(duì)稱型雙抗：這種類型的雙抗通常具有衍生自兩種不同親本mAb的重鏈和輕鏈。其中輕鏈和/或重鏈的部分或全部也可以設(shè)計(jì)為在可能的情況下在兩個(gè)臂上相等，以最大限度地減少錯(cuò)誤配對(duì)。 

（ii）對(duì)稱型雙抗：對(duì)稱型雙抗同樣包含F(xiàn)c片段，其兩側(cè)的結(jié)構(gòu)域序列呈現(xiàn)對(duì)稱性，通過附加到抗體上的額外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域如scFv來實(shí)現(xiàn)多重特異性。

（iii）基于片段的雙抗：這類雙抗由可變區(qū)通過不同的連接方式構(gòu)成，例如BiTE結(jié)構(gòu)（一個(gè)scFv的VH與其自身的VL相連，同時(shí)也與另一個(gè)scFv的VL相連）和Diabody結(jié)構(gòu)（兩個(gè)scFv不與其自身的VL和VH相連，而是分別與對(duì)方的VH和VL相連）。

Fig.2 雙特異性抗體的三種主要結(jié)構(gòu)
 

雙特異性抗體的設(shè)計(jì)復(fù)雜性經(jīng)常伴隨著多種副產(chǎn)物的產(chǎn)生，這些副產(chǎn)物極大地增加了后續(xù)純化步驟的挑戰(zhàn)性。以下是對(duì)幾種主要副產(chǎn)物及其形成原因的分析：

同源二聚體

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，由于多種重鏈（HC）和輕鏈（LC）的共表達(dá)，雙抗容易發(fā)生HC和LC的錯(cuò)配現(xiàn)象，導(dǎo)致大量具有相似大小和性質(zhì)的非功能性或單特異性抗體的產(chǎn)生，也稱為同源二聚體。

為了減少錯(cuò)配，可以通過分子設(shè)計(jì)來提高目標(biāo)雙抗的形成概率。例如，廣泛應(yīng)用的Knob-into-Hole（KiH）技術(shù)，但同源二聚化仍不能被完全消除。

片段缺失

缺失HC或LC的雙抗片段是常見的副產(chǎn)物，例如1/2 BsAb（缺少一條HC和一條LC）和3/4 BsAb（缺少一條LC）。

聚集體形成

雙抗分子的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，形式多樣，而且分子結(jié)構(gòu)特殊，易受到各種物理、化學(xué)和細(xì)胞生長(zhǎng)壓力的影響而產(chǎn)生聚集體。

研究表明，基于片段的BsAb由于Fc區(qū)的缺失，比傳統(tǒng)的IgG更容易形成聚集體。對(duì)稱型BsAb也被觀察到具有較高的聚集體傾向（聚集體比例高達(dá)50%）。這種傾向可能部分由于鏈長(zhǎng)度和靈活性的增加，導(dǎo)致分子間結(jié)構(gòu)域更容易發(fā)生交換。
 

同源二聚體的去除

同源二聚體與雙抗分子的物理化學(xué)性質(zhì)都十分的相似，因此需要結(jié)合目標(biāo)雙抗分子與同源二聚體之間的結(jié)構(gòu)、親和力、電荷性質(zhì)及疏水性的差異來制定純化策略。

以下為親和、離子交換和復(fù)合模式層析方法對(duì)同源二聚體進(jìn)行分離的具體案例。

· Protein A/L親和層析

Protein A可以特異性地結(jié)合IgG1或IgG4的Fc區(qū)域。通過改變重鏈與Protein A的結(jié)合能力，可以利用Protein A與同源二聚體之間的結(jié)合差異來去除同源二聚體。而不同輕鏈的設(shè)計(jì)可避免重鏈錯(cuò)配，依據(jù)同源二聚體與完整抗體在Kappa輕鏈結(jié)構(gòu)上的親和力差異，使用Protein L填料實(shí)現(xiàn)同源二聚體的有效分離。

· 離子交換層析

利用目標(biāo)雙抗與同源二聚體之間pI的差異，使用離子交換層析進(jìn)行分離。文獻(xiàn)報(bào)道^[2]的案例中通過質(zhì)譜確認(rèn)了目標(biāo)BsAb的pI為7.24，同源二聚體的pI為8.04。使用Diamond Q（陰離子填料）類型填料，在選定的上樣、淋洗條件（pH7.5和電導(dǎo)率5mS/cm）和上樣載量（80mg/mL）下運(yùn)行，帶正電荷的同源二聚體從層析填料上流穿，實(shí)現(xiàn)了與目標(biāo)分子的良好分離。

· 復(fù)合模式層析

MMC在離子相互作用的基礎(chǔ)上，另外具備了疏水、氫鍵和嗜硫作用，可利用同源二聚體與目標(biāo)雙抗在疏水性以及表面電荷上的差異對(duì)其進(jìn)行去除。

文獻(xiàn)報(bào)道^[3]的案例中，使用Diamond MMC Mustang（陽離子復(fù)合填料）類型填料，在選定的上樣條件（即pH5.5和電導(dǎo)率5mS/cm）和上樣載量（30mg/mL）下運(yùn)行，通過優(yōu)化淋洗步驟，將淋洗條件優(yōu)化為50mM His-HCl, 63mM NaCl, pH6.5，可以有效去除半抗和Knob-Knob同源二聚體。雖然Knob-Knob同二聚體結(jié)合比半抗體略強(qiáng)，但比靶BsAb弱得多，仍然可以在淋洗步驟被去除。

低分子量片段的去除

半抗體是雙抗分子組裝過程一種常見的副產(chǎn)物，是由于部分重鏈或輕鏈過表達(dá)，并且由于空間位阻等原因無法形成同源二聚體而產(chǎn)生的雜質(zhì)。3/4抗體則主要是由于二硫鍵斷裂導(dǎo)致雙抗分子的一條輕鏈缺失所產(chǎn)生的雜質(zhì)。

以下為通過親和、復(fù)合模式、離子交換層析方法對(duì)半抗、3/4抗等低分子量片段進(jìn)行分離的具體案例。

· Protein A親和層析

半抗僅含一個(gè)Fc區(qū)，相較于含兩個(gè)Fc區(qū)域的目標(biāo)抗體分子來說，半抗與親和填料結(jié)合能力弱，比目標(biāo)分子更早洗脫，可通過pH線性梯度或等度pH洗脫去除。

· 復(fù)合模式層析

MIX-A除了陰離子作用外，還具有疏水及氫鍵作用，可有效去除聚體、DNA、宿主蛋白、內(nèi)毒素、Protein A等雜質(zhì)。

在測(cè)試的對(duì)稱型雙抗案例中，使用Diamond MIX-A Mustang（陰離子復(fù)合填料），在選定的上樣條件（pH7.0）和上樣載量（30mg/mL）下運(yùn)行，通過優(yōu)化淋洗步驟，將淋洗條件優(yōu)化為20mM PB, 0.3M Arg-Cl, pH7.0，可以有效地去除ScFv缺失的副產(chǎn)物，且不會(huì)淋洗出目的蛋白，洗脫產(chǎn)品SEC純度提高了8%。

· 離子交換層析

利用目標(biāo)雙抗與低分子量片段之間所帶電荷的差異，使用離子交換層析通過pH或者鹽梯度進(jìn)行分離。

在測(cè)試的雙抗案例中，BsAb的pI為7.7，使用MegaPloy BXS（陽離子填料），在選定的上樣條件（pH6.0）和上樣載量（60mg/mL）下運(yùn)行，洗脫步驟使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 進(jìn)行0~100% B線性梯度洗脫。層析圖譜上發(fā)現(xiàn)低分子量的片段在洗脫峰尾出現(xiàn)了單獨(dú)的第二個(gè)較小的洗脫峰，通過SEC-HPLC和NR CE-SDS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)收集產(chǎn)品SEC提高了8.7%，CE-NR提高了10.5%，說明片段被明顯去除。

在測(cè)試的相同雙抗案例中，使用Diamond CD-S（陽離子填料），在選定的上樣條件（pH6.0）和上樣載量（60mg/mL）下運(yùn)行，洗脫步驟使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 進(jìn)行0~100% B線性梯度洗脫。層析圖譜上發(fā)現(xiàn)低分子量的片段在洗脫峰尾同樣出現(xiàn)了單獨(dú)的第二個(gè)較小的洗脫峰，通過SEC-HPLC和NR CE-SDS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)收集產(chǎn)品SEC提高了7.3%，CE-NR提高了11.0%，說明片段同樣能夠被Diamond CD-S有效去除。

高分子量聚集體的去除

在雙特異性抗體生產(chǎn)過程中，由于肽鏈的延伸提高了肽鏈的長(zhǎng)度和靈活性，加劇了分子間的肽鏈纏繞，使得聚集體極易形成。此外，親和層析低pH洗脫條件也容易造成聚集體的形成。

以下為通過疏水和復(fù)合模式層析方法對(duì)高分子量聚集體進(jìn)行分離的具體案例。

· 疏水層析

疏水層析在去除聚集體上效果突出。聚集體的疏水性比單體強(qiáng)，疏水層析可通過目標(biāo)分子流穿模式去除聚集體。對(duì)于自身疏水性很強(qiáng)的目標(biāo)分子可選用疏水性相對(duì)較弱的Octyl、Butyl填料篩選上樣條件，也可選用高分辨疏水填料進(jìn)行洗脫分離聚體和目標(biāo)抗體。

文獻(xiàn)報(bào)道^[4]的案例中，目標(biāo)產(chǎn)品為對(duì)稱型雙抗，首先使用Phenyl Bestarose HP（疏水填料）類型填料進(jìn)行常規(guī)的遞減硫酸鈉梯度洗脫，以確定基線純度和回收率水平。在pH8下，使用遞減的硫酸鈉線性梯度（0.4~0M）進(jìn)行洗脫，層析圖譜上發(fā)現(xiàn)洗脫峰分離效果不明顯，收集產(chǎn)品在SEC大于99%的純度下，收率僅為35.7%。通過優(yōu)化后的洗脫條件，在使用遞減的硫酸鈉線性梯度（0.4~0M）上疊加遞增的精氨酸（0~1M）線性梯度，層析圖譜上洗脫峰出現(xiàn)明顯的拖尾，同時(shí)收集產(chǎn)品在SEC大于99%的純度下，收率為81.7%，提高了46%，說明聚集體與目標(biāo)產(chǎn)品明顯分離。

· 復(fù)合模式層析

Diamond MMC Mustang在雙抗的精純上應(yīng)用非常廣泛，對(duì)降解片段、電荷異構(gòu)體以及聚集體等副產(chǎn)品有較好的去除效果。

文獻(xiàn)報(bào)道^[5]的案例中，目標(biāo)產(chǎn)品為非對(duì)稱型雙抗，使用Diamond MMC Mustang（復(fù)合模式填料），在選定的上樣條件（硫酸銨濃度調(diào)節(jié)到1M，pH7.0）和載量（30mg/mL）下運(yùn)行，洗脫步驟使用A: 50 mM Tris-HAc, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH7.0和B: 50 mM Tris-HAc, pH7.0, 進(jìn)行0~100% B線性梯度洗脫。

通過Fig.3可以發(fā)現(xiàn)半抗以及高分子量雜質(zhì)在洗脫峰尾富集，并且與目標(biāo)雙抗明顯的分離。在這種情況下，主要是利用目標(biāo)雙抗和高分子量聚集體之間疏水性差異實(shí)現(xiàn)分離。同時(shí)根據(jù)圖譜來看，Diamond MMC Mustang與某進(jìn)口復(fù)合模式填料（MMC）在分離效果和產(chǎn)品質(zhì)量上基本保持一致。

Fig.3 使用Diamond MMC Mustang和某進(jìn)口復(fù)合模式層析柱在線性鹽梯度洗脫條件下的疊加層析圖譜
 

BsAb的復(fù)雜結(jié)構(gòu)帶來了多種純化挑戰(zhàn)，但通過合理的設(shè)計(jì)和純化策略，可以有效提高目標(biāo)BsAb的純度和產(chǎn)量。這些策略包括親和層析、離子交換層析、復(fù)合模式層析和疏水層析等，每種方法都有其特定的應(yīng)用場(chǎng)景和優(yōu)勢(shì)。

通過使用不同層析原理的填料進(jìn)行有效組合，使得雜質(zhì)在精純層析步驟中盡可能多的去除，最終得到穩(wěn)健的下游工藝，使雙特異性抗體產(chǎn)品質(zhì)量滿足放行要求。

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