重組抗體藥物制備的下游純化工藝，主要目的是分離純化去除工藝相關(guān)雜質(zhì)，如內(nèi)毒素、病毒、HCP、HCD等和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)等。

其中，HCP，即宿主細胞蛋白（Host Cell Protein）是表達重組抗體宿主細胞產(chǎn)生的、具有不同理化性質(zhì)的復(fù)雜內(nèi)源性蛋白質(zhì)復(fù)合物，因其自身帶來的免疫原性和潛在的蛋白酶水解活性等，會嚴重影響抗體藥物的穩(wěn)定性和功效，被認為是抗體藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。HCP的去除也因此成為抗體下游工藝的關(guān)鍵目標之一。通常最終抗體藥物原液中殘留HCP的普遍接收范圍在1~100ppm。

以常見的中國倉鼠卵巢（CHO）宿主細胞生產(chǎn)抗體為例，在下游工藝中，主要通過親和層析、深層過濾、離子交換層析及多模式層析等純化步驟來降低HCP水平。

親和層析由于對抗體的高度結(jié)合特異性，是抗體下游純化最常用的捕獲層析方法。親和層析高度選擇性的特點，是去除HCP的有效手段。

HCP和親和層析填料間的非特異性結(jié)合對HCP殘留起到的作用很小。然而，HCP與目的蛋白之間存在多位點的非特異性相互作用，會導(dǎo)致下游純化中兩者共純化，成為親和洗脫液中HCP存在的主要原因。

為盡量減少樣品中HCP的水平，通常在目的蛋白洗脫之前進行中間淋洗。該步驟優(yōu)化的重點在于破壞HCP與親和層析介質(zhì)和/或抗體之間的相互作用。通常選用介于平衡和洗脫緩沖液之間的pH范圍（如pH 5.0~6.5）進行淋洗，以去除與親和層析介質(zhì)非特異性結(jié)合的HCP。但這對與目標抗體蛋白有相互作用的HCP的去除效果有限，且低pH的中間淋洗步驟有可能會影響收率，尤其在高上樣載量時。

對于此種情況，可以采用堿性淋洗緩沖液（pH 8.0~10.0）來打破抗體與HCP之間的相互作用，從而達到除去HCP的目的。

此外，在淋洗步驟過程中，除對緩沖體系及pH進行優(yōu)化外，添加一定量的鹽或添加劑（例如：尿素、精氨酸、丙二醇和triton X-100等）也可顯著破壞HCP與目的蛋白之間的靜電，疏水和氫鍵相互作用。通過淋洗，可以除去柱上結(jié)合的HCP，從而顯著降低洗脫液中HCP的水平。

Table 1. 常用淋洗添加劑及添加濃度

Table 2. 與mAb的Fab和Fc結(jié)構(gòu)域被鑒定為強結(jié)合HCP的蛋白質(zhì)

親和層析洗脫的樣品，在經(jīng)過低pH（pH 3.5~3.8）病毒滅活后，需進行回調(diào)中和pH來與后續(xù)層析步驟進行銜接。大部分HCP（pI 4.5~7.0）在調(diào)節(jié)pH時會被跨越等電點，使溶解性降低。

對低pH病毒滅活后的回調(diào)pH值進行優(yōu)化，可以選擇最佳中和pH來選擇性的有效聚集或沉淀HCP。除此之外，也可以通過添加劑如辛酸、聚乙二醇等最大限度地沉淀HCP，同時最大限度地減少目標產(chǎn)物損失。這些經(jīng)處理后的料液再通過深層過濾器對HCP的吸附特性來達到有效去除HCP的效果。

親和層析和深層過濾通�？梢匀コ�90%以上的HCP，但若仍無法達到目標HCP殘留要求以下，則還需要通過精純步驟進行去除，常用方法即為離子交換層析。

由于大多數(shù)抗體與HCP相比具有較高的等電點（pI 6.5~9.0），因此可采用陰離子層析流穿模式去除HCP，即在低于抗體蛋白等電點的pH和低電導(dǎo)條件下進行上樣。因大部分HCP的等電點低，此上樣條件下HCP多帶負電與介質(zhì)結(jié)合，而抗體蛋白帶正電不與介質(zhì)結(jié)合，而是從陰離子層析柱中流穿，從而將抗體與HCP進行分離。陰離子層析可通過對上樣條件的緩沖液種類、離子強度和pH等條件進行優(yōu)化。對于陰離子弱結(jié)合模式，還可以通過增加上樣量和上樣后淋洗等方式來優(yōu)化提高收率。

陽離子交換層析則主要以結(jié)合洗脫模式去除產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)。除了對緩沖液種類、離子強度和pH等條件優(yōu)化，上樣條件、淋洗策略與洗脫條件優(yōu)化對于去除HCP和提高產(chǎn)品質(zhì)量也很重要。此外，陽離子交換層析也可以通過弱結(jié)合流穿模式去除HCP和聚集體。

相較其他單一模式層析，多模式層析具有更高的選擇性�？贵w表面疏水和帶電荷的分布與大多數(shù)HCP表面分布不同。多模式離子層析介質(zhì)利用疏水與離子協(xié)同作用，可在去除HCP等雜質(zhì)上表現(xiàn)出較單一模式層析更優(yōu)秀的性能。但也正因為多模式層析固有的復(fù)雜性（兼具多種由不同因素影響的相互作用），為了充分利用該種層析，需要進行廣泛的優(yōu)化。

比如，對pH的優(yōu)化，可以控制離子相互作用和結(jié)合能力，有利于提高回收率；而對電導(dǎo)率（上樣、淋洗及洗脫鹽濃度）的優(yōu)化則決定了結(jié)合以及洗脫時的疏水相互作用。此外，添加劑如精氨酸等的使用也可以提高多模式層析的分離性和/或選擇性。

實現(xiàn)HCP的充分去除是抗體藥物生產(chǎn)的一個關(guān)鍵目標，這主要取決于上游細胞培養(yǎng)工藝控制與下游純化工藝控制。在抗體下游純化工藝中，需要靈活應(yīng)用不同方法，結(jié)合不同分離原理清除HCP。

為了最大限度地去除HCP并提高工藝穩(wěn)健性，對工藝中的每個步驟進行優(yōu)化是至關(guān)重要的。這些不同HCP去除策略的綜合運用對保證抗體藥物的穩(wěn)定性和功效至關(guān)重要。
 

[2] Li, Yifeng. (2017). Effective strategies for host cell protein clearance in downstream processing of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. Protein Expression and Purification, 134(), 96–103. doi:10.1016/j.pep.2017.04.006

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