早在 19 世紀(jì) 40 年代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一種可以在細(xì)胞之間互相轉(zhuǎn)移的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，并提出了多種猜測(cè)，包括寄生蟲、共生體、基因等。但命名始終未得到最終的確認(rèn)。

直到 1952 年，Joshua Lederberg 開始著手闡明這些細(xì)胞質(zhì)遺傳因子的分類，并首次提出了 “Plasmid” 這個(gè)名稱。“Plasmid” 是 “Cytoplasm” 和 “id”（拉丁語(yǔ)中的 ‘it’ ）的整合體，并將其作為 “任何染色體外遺傳決定因子” 的通用術(shù)語(yǔ)。

Fig.1 質(zhì)粒

質(zhì)粒是小的環(huán)狀超螺旋雙鏈 DNA，在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于染色體外自主復(fù)制并穩(wěn)定遺傳，可通過(guò)基因工程改造接入外源 DNA 作為基因載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。

如今，質(zhì)粒已成為生物制藥領(lǐng)域中最重要的工具之一，可用于克隆，擴(kuò)增和表達(dá)目的蛋白；也可用于病毒載體和 mRNA 的生產(chǎn)等領(lǐng)域。

質(zhì)粒有多種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包括超螺旋質(zhì)粒、開環(huán)質(zhì)粒、線性質(zhì)粒，其中超螺旋質(zhì)粒被認(rèn)為是活性最高的組分，而開環(huán)質(zhì)粒由于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞效率較低，需要在質(zhì)粒成品中嚴(yán)格控制其含量。

博格隆的質(zhì)粒純化三步法工藝具有穩(wěn)健、高效、可放大的特點(diǎn)，助力您獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的高純度質(zhì)粒。
 

Fig.2 質(zhì)粒生產(chǎn)流程
 

• 獲得一定規(guī)模的高純度超螺旋 DNA（ssDNA）

• 去除產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：開環(huán) DNA（ocDNA），質(zhì)粒 DNA 聚集體（dimer，trimer，tetramer，etc.）

• 去除工藝相關(guān)雜質(zhì)：HCP，HC-DNA，HC-RNA

• 控制生物負(fù)荷：內(nèi)毒素，微生物

• 工藝流程穩(wěn)健，可重復(fù)性好

• 可進(jìn)行線性放大
 

• 樣品準(zhǔn)備：中空纖維濃縮后樣品

• 6FF 層析目的在于快速去除大量 RNA，收率一般在 90% 以上

• Buffer：2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

• 柱高可選擇 30~50cm

• 進(jìn)樣量控制在 15~25% CV

• 操作流速 60~120cm/h

• 收集到的流穿，超螺旋比例基本在 80% 左右

Fig.3凝膠過(guò)濾圖譜

高效分離超螺旋質(zhì)粒（scDNA）和開環(huán)質(zhì)粒（ocDNA），去除開環(huán) DNA，收率一般大于 80%，經(jīng)過(guò)該步純化后，超螺旋比例在 95% 左右。

Buffer A：2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA 100mM Tris, pH7.5

Buffer B：1.7M(NH₄)₂SO₄-0.3M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

• 堿洗：0.5M NaOH  2~3CV，靜置 15~30min

• 水洗：2~3CV

• 平衡：BufferA 2~3CV，至 pH、Cond 平衡

• 上樣：不超過(guò) 2.5mg/mL，保留時(shí)間不低于 3min

• 清洗：Buffer A 清洗 3~5CV

• 洗脫：Buffer B 洗脫

Fig.4 親和層析圖譜

利用高分辨率去除殘留內(nèi)毒素及痕量雜質(zhì)，收率一般可達(dá) 80%。

Buffer A：0.4M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

Buffer B：1.0M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

樣品：親和洗脫液與 TE Buffer 進(jìn)行 1:2 稀釋
 

層析過(guò)程：

• 堿洗：0.5M NaOH  2~3CV，靜置 15~30min

• 水洗：2~3CV

• 平衡：Buffer A 2~3CV，至 pH、Cond 平衡

• 上樣：不超過(guò) 2mg/mL，保留時(shí)間不低于 3min

• 清洗：Buffer A 清洗 3~5CV

• 洗脫：Buffer B 洗脫

Fig.5 陰離子交換層析圖譜
 

為方便質(zhì)粒純化后實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，博格隆推出 Ezscreen Bestarose 6HP 預(yù)裝柱，用于質(zhì)粒定量分析。

Fig.6 質(zhì)粒分析圖譜
 

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