蛋白純化是重組蛋白生產(chǎn)流程中關(guān)鍵的下游步驟（Fig.1）。由于重組蛋白自身在化學(xué)與結(jié)構(gòu)上的多樣性，親和標(biāo)簽已成為實現(xiàn)高通量蛋白純化的有效手段，可在復(fù)雜背景下特異性富集低豐度蛋白，不僅可以提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量還可賦予目標(biāo)蛋白質(zhì)新的特性^[1]。
His-Tag（通常為 6 個組氨酸）作為目前最常用的蛋白質(zhì)純化親和標(biāo)簽[2]，具有以下特點：
• 分子量小，易表達(dá)，免疫原性低
• 可與其他標(biāo)簽構(gòu)建組合標(biāo)簽
• 洗脫條件溫和，易于再生
• 成本低

Fig. 1  A. 通過與目標(biāo)蛋白基因融合的His 標(biāo)簽獲得純重組多肽流程示意圖

B. Ni-NTA 和組氨酸咪唑環(huán)之間配位鍵的放大顯示^[3]

注：活動順序涉及基因設(shè)計、克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生產(chǎn)、

基于 His 標(biāo)簽在鎳柱（I）中結(jié)合，

隨后使用咪唑（II）進(jìn)行洗脫。
 

組氨酸殘基中咪唑環(huán)的給電子體基團(tuán)可與金屬形成配位鍵[4]，因此，在純化過程中，改變標(biāo)簽蛋白與金屬離子之間作用力的強(qiáng)弱即可純化目標(biāo)蛋白。
純化時，通常選擇在緩沖液中加入高濃度的咪唑，咪唑與組氨酸標(biāo)簽蛋白競爭性結(jié)合金屬離子，將目標(biāo)蛋白洗脫下來。
此外，也可適當(dāng)降低緩沖液 pH，以此減弱標(biāo)簽蛋白與金屬離子結(jié)合能力，達(dá)到蛋白分離純化的目的。

Fig. 2  組氨酸與咪唑結(jié)構(gòu)式
 

針對 His 標(biāo)簽蛋白的純化，博格隆提供了三類 His 標(biāo)簽純化產(chǎn)品（Fig.3），包括已鰲合 Ni²⁺ 的 Ni Bestarose FF/HP 以及未預(yù)先鰲合金屬離子的 IMAC Bestarose FF/HP 與 Chelating Bestarose FF。

Fig.3  博格隆 His 標(biāo)簽純化產(chǎn)品

Ni Bestarose FF/HP 是將金屬離子 Ni²⁺ 鰲合在以氨三乙酸（NTA）為配基的 6% 高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠上的親和層析介質(zhì)。
其中，Ni Bestarose FF 平均粒徑為 90 μm，具有載量高、流速快、易再生等優(yōu)點；Ni Bestarose HP 平均粒徑為 34 μm，相較于 Ni Bestarose FF，具有更高的分辨率。
IMAC Bestarose HP/FF 與 Chelating Bestarose FF 均是未預(yù)先鰲合金屬離子的介質(zhì)，可供客戶自行選擇金屬離子（Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺等）進(jìn)行偶聯(lián)。
IMAC 與 Chelating 在配位方式上有所不同，Chelating Bestarose FF 介質(zhì)的配基可提供 3 個配位位點同金屬離子螯合，同時提供 3 個離子鍵結(jié)合部位高親和地純化目的蛋白；IMAC Bestarose FF 介質(zhì)提供 4 個配位位點同金屬離子螯合，2 個離子鍵結(jié)合部位純化目的蛋白（Fig. 4）。

Fig.4  氨三乙酸（NTA）與亞氨基二乙酸（IDA）配位方式

在相同的配基密度、相同金屬離子條件下，Chelating Bestarose FF 介質(zhì)較 IMAC Bestarose FF 的親和力更強(qiáng)，但同時 IMAC Bestarose FF 介質(zhì)因為多一個金屬離子螯合位點，結(jié)合金屬離子的能力更強(qiáng)，還可以同還原劑 DTT 及 β- 巰基乙醇兼容。因此，在純化重組組氨酸標(biāo)簽蛋白時應(yīng)根據(jù)蛋白特點選擇介質(zhì)。

Fig.5  His 標(biāo)簽蛋白純化親和填料選擇指南
 

使用 Ni Bestarose FF 純化帶有 His 標(biāo)簽的熒光蛋白
• 填料：Ni Bestarose FF （1 mL EzFast）；
• 樣品：大腸桿菌裂解液；
• Buffer A：25mM咪唑   pH 7.0；
• Buffer B：500mM咪唑   pH 7.0；
• 流速：1 mL/min。

Fig.6  Ni Bestarose FF 純化熒光蛋白層析圖譜及SDS-PAGE 結(jié)果

如 Fig.6 所示，Ni Bestarose FF 具有良好的純化效果。
Tips：由于 Ni 柱不可耐受 DTT、EDTA 等強(qiáng)還原劑與強(qiáng)螯合劑，一般在進(jìn)行蛋白純化之前建議通過透析或脫鹽的方式進(jìn)行置換緩沖液。
在產(chǎn)品選擇方面，推薦使用 Bestdex G-25 M 凝膠過濾填料或預(yù)裝柱進(jìn)行脫鹽或緩沖液置換。
Bestdex G-25 M 具有親水多孔的特點，利用分子篩原理可快速便捷地處理高達(dá)脫鹽柱總體積 30％ 的樣品，有效提高His標(biāo)簽蛋白與 Ni 柱結(jié)合能力，同樣經(jīng) Ni 柱純化后的洗脫樣品也可使用 Bestdex G-25 M 去除高濃度咪唑。
 

Table1．Ni填料技術(shù)參數(shù)

Table2．金屬鰲合親和填料技術(shù)參數(shù)

Table3．Bestdex G-25 M技術(shù)參數(shù)

參考文獻(xiàn)
[1] Loughran ST, Bree RT, Walls D. Purification of Polyhistidine-Tagged Proteins. Methods Mol Biol. 2017; 1485:275-303.
[2] Waugh DS. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 2005 Jun;23(6):316-20.
[3] López-Laguna H, Voltà-Durán E, Parladé E, Villaverde A, Vázquez E, Unzueta U. Insights on the emerging biotechnology of histidine-rich peptides. Biotechnol Adv. 2022 Jan-Feb; 54:107817.
[4] Watly J, Simonovsky E, Wieczorek R, Barbosa N, Miller Y, Kozlowski H. Insight into the coordination and the binding sites of Cu (2+) by the histidyl-6-tag using experimental and computational tools. Inorg Chem. 2014 Jul 7;53(13):6675-83.