從源頭到工藝：內(nèi)毒素控制與去除全解析
內(nèi)毒素（Endotoxin）是革蘭陰性菌外膜不可或缺的結(jié)構(gòu)成分，是在細(xì)菌繁殖過程中以及菌體崩解、自溶時所釋放出的毒性物質(zhì)，其主要成分為脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。
在生物制品的生產(chǎn)過程中，內(nèi)毒素是常見且嚴(yán)重的污染源。內(nèi)毒素污染不僅會影響生物制品的純度，還可能引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，嚴(yán)重情況下甚至?xí)䦟?dǎo)致患者出現(xiàn)發(fā)熱、休克等不良反應(yīng)。因此，在生物制品的生產(chǎn)工藝中，內(nèi)毒素的去除和檢測至關(guān)重要，是保障產(chǎn)品安全性的核心步驟。
Fig.1 內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)示意圖（圖片引自Monteiro和Faciola，2020）
內(nèi)毒素有單體、膠束或囊狀的存在形式。內(nèi)毒素以膠束、立方體、層狀或囊泡形式聚集，在藥物溶液中呈現(xiàn)凈負(fù)電荷。帶負(fù)電荷的“膠束”內(nèi)毒素可以吸附在多聚陽離子配體上，或者可以通過疏水脂質(zhì)尾部與疏水表面的相互作用去除單個內(nèi)毒素單體。
Fig.2 內(nèi)毒素存在形式
內(nèi)毒素污染主要來自兩大方面：
• 生產(chǎn)系統(tǒng)污染：在基因工程生產(chǎn)中，大腸桿菌常用于表達(dá)重組蛋白。在細(xì)胞破壁和純化過程中，細(xì)菌內(nèi)毒素會大量釋放到溶液中，成為主要污染源。通常10%的濕菌濃度可產(chǎn)生幾萬EU/mL的內(nèi)毒素。
• 原材料和環(huán)境污染：即便使用CHO細(xì)胞或酵母等不產(chǎn)生內(nèi)毒素的表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)所用的原輔材料、溶液、生產(chǎn)環(huán)境以及操作過程中的污染，依然可能引入內(nèi)毒素。
Fig.3 生產(chǎn)過程中內(nèi)毒素污染控制
為了保障生物制品的安全性，內(nèi)毒素檢測是必不可少的一環(huán)。常見的檢測方法包括：
本法作為最早的熱原檢查法仍收錄在現(xiàn)行版《中國藥典》中。由于家兔對熱原的反應(yīng)與人基本相似，所以采用家兔耳緣靜脈注射的方式，監(jiān)測家兔體溫，用來定性檢測熱原。這種方法較為傳統(tǒng)，但在敏感性和環(huán)保性方面有所限制。
鱟試劑（LAL）法
鱟試劑（LAL）法包括凝膠法和光度測定法，其中凝膠法包括凝膠限度試驗(yàn)和凝膠半定量試驗(yàn)兩種，為《中國藥典》規(guī)定的“仲裁”方法；光度測定法又分為濁度法（包括終點(diǎn)濁度法和動態(tài)濁度法）和顯色基質(zhì)法（包括終點(diǎn)顯色法和動態(tài)顯色法）。該方法利用鱟試劑中的凝膠酶與內(nèi)毒素反應(yīng)，被廣泛用于檢測。其具有操作簡便、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
重組C因子法
以重組技術(shù)生產(chǎn)C因子作為替代試劑，不僅能夠有效檢測內(nèi)毒素，還避免了對自然資源（鱟蟹）的過度依賴，具有環(huán)保和可持續(xù)性的優(yōu)勢。
Fig.4 內(nèi)毒素檢測發(fā)展史
如何有效去除生物制品中的內(nèi)毒素成為生物制品安全性與質(zhì)量保障的關(guān)鍵。內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)特征是去除細(xì)菌內(nèi)毒素的基礎(chǔ)，目前已形成多種內(nèi)毒素去除層析工藝，包括疏水層析法、離子交換層析法、親和層析法和凝膠過濾法等。
利用內(nèi)毒素在pH>2時帶負(fù)電的特性，通過帶正電荷的填料結(jié)合并去除。陰離子交換層析法適用于低鹽濃度條件下的樣品�？墒褂昧鞔┠Ｊ�，上樣前將樣品pH控制在目的蛋白pI以下，使其帶正電。這樣內(nèi)毒素結(jié)合在填料上，目的蛋白直接流穿。
疏水層析
疏水層析法利用高鹽增加蛋白疏水性與介質(zhì)結(jié)合。在高鹽體系中，內(nèi)毒素由于脂質(zhì)A部分有很強(qiáng)的疏水性發(fā)生凝集，無法與層析介質(zhì)結(jié)合，因此能夠有效去除內(nèi)毒素。
凝膠過濾層析
內(nèi)毒素可在水溶液中以非極性和離子相互作用，形成大小為1,000kDa 分子聚集體，它與多數(shù)生物蛋白分子量差異較大�；谶@一特征，可以采用凝膠過濾層析，將大分子內(nèi)毒素分子與目標(biāo)蛋白分離。
親和層析
使用特異性吸附內(nèi)毒素的配基（如多粘菌素B），能夠高效去除樣品中的內(nèi)毒素。
復(fù)合模式層析
結(jié)合電荷、疏水性和氫鍵等多種相互作用機(jī)制，復(fù)合模式填料能夠在一步操作中高效去除內(nèi)毒素，適用于要求高純度的產(chǎn)品。
內(nèi)毒素的檢測與去除是確保生物制品安全性和高質(zhì)量生產(chǎn)的核心步驟。通過科學(xué)選擇去除技術(shù)和高效的層析填料，不僅能有效降低內(nèi)毒素含量，還能提升純化效率，符合嚴(yán)格的國際法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。為應(yīng)對內(nèi)毒素去除的挑戰(zhàn)，博格隆推出了一系列高效的層析產(chǎn)品，為生物制藥行業(yè)提供可靠的解決方案，助力企業(yè)提升產(chǎn)品質(zhì)量和效率。
