二代測(cè)序（NGS）是基于PCR和基因芯片技術(shù)，由一代測(cè)序發(fā)展而來(lái)的，可以平行測(cè)序的技術(shù)，具有通量高，速度更快的優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行NGS實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要把樣本DNA提取之后，在進(jìn)行建庫(kù)，然后上機(jī)測(cè)試，最后獲得數(shù)據(jù)后，進(jìn)行生信分析。在測(cè)序整個(gè)流程中，對(duì)于樣本質(zhì)量的要求非常高。低質(zhì)量的DNA以及建庫(kù)產(chǎn)物，會(huì)影響到文庫(kù)轉(zhuǎn)化率，測(cè)序的深度，復(fù)雜性和均一性等指標(biāo)。所以測(cè)序做的好不好，質(zhì)控很重要。

圖 1 NGS建庫(kù)和質(zhì)控流程示例

安捷倫質(zhì)控儀器，例如2100生物分析儀，Tapestation系統(tǒng)和片段化分析儀等，均可以對(duì)NGS全流程進(jìn)行質(zhì)控。今天魯大師就帶著大家看看NGS質(zhì)控要點(diǎn)。

測(cè)序樣本質(zhì)控
· 基因組DNA
影響因素：儲(chǔ)存條件，例如溫度，儲(chǔ)存環(huán)境、提取方法
安捷倫獨(dú)創(chuàng)DIN值，數(shù)字化評(píng)判g(shù)DNA質(zhì)控，使電泳圖的解釋更容易，便于樣品的比較，并為NGS技術(shù)提供了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和高質(zhì)量基因組DNA的定量

圖 2 使用安捷倫gDNA ScreenTape assay 分析gDNA，DIN值越大，gDNA質(zhì)量越好

· RNA
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣本制備從提取RNA。RNA完整性對(duì)于下游建庫(kù)和測(cè)序尤為重要。

圖 3 使用片段化分析儀進(jìn)行RNA 完整性分析. RQN為該儀器數(shù)字化評(píng)判RNA完整性的指標(biāo)， RQN值越大，完整性越好。

RNA-seq cDNA合成
RNA-seq文庫(kù)制備的一個(gè)重要步驟是將mRNA從總RNA中分離出來(lái)，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為cDNA(互補(bǔ)DNA)，用于后續(xù)的文庫(kù)制備步驟和測(cè)序。

圖 4 RNA-seq文庫(kù)的制備步驟通過(guò)安捷倫片段分析儀系統(tǒng)進(jìn)行QC。顯示的是代表性步驟的電泳圖：?jiǎn)渭?xì)胞(A)cDNA擴(kuò)增。(B)cDNA擴(kuò)增作為陽(yáng)性對(duì)照。(C)A為陰性對(duì)照，無(wú)細(xì)胞。(D)最終的NGS庫(kù)

片段質(zhì)量評(píng)估
目標(biāo)DNA片段的大小是NGS文庫(kù)構(gòu)建的關(guān)鍵因素。對(duì)核酸進(jìn)行片段化的方法主要包括物理打斷和酶打斷。物理方法包括聲波剪切（和超聲，酶切方法包括非特異性內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)座酶片段化。根據(jù)需求，DNA片段長(zhǎng)度可在150–800 bp之間。

圖 5 PCR擴(kuò)增子片段到350~500bp大小，以獲得合適的測(cè)序樣本。使用安捷倫片段分析儀系統(tǒng)來(lái)評(píng)估碎片化的程度。(A)非片段PCR擴(kuò)增子在964bp。(B)超聲打斷 C和D重復(fù)超聲打斷技術(shù)，顯示出廣泛的片段模式，峰值約為390bp，是下游測(cè)序的理想選擇

接頭連接
片段化后的DNA需要加上接頭。 接頭其實(shí)就是一段已知的短核苷酸序列，用于鏈接未知的目標(biāo)測(cè)序片段。接頭添加方式不盡相同，但是接頭連接情況，我們可以通過(guò)安捷倫質(zhì)控儀器進(jìn)行檢測(cè)。

圖 6 使用安捷倫Tapestation系統(tǒng)的進(jìn)行接頭連接的QC。(A)input DNA（紅色）和接頭（藍(lán)色）示意圖 (B)接頭在75bp處有一個(gè)峰值 (C)input DNA在165bp (D)以B和C為參考，四個(gè)峰值：接頭，input DNA,單端接頭，雙端接頭 (E)加號(hào)接頭的文庫(kù)最終產(chǎn)物和(F)pcr后帶有雙端接頭DNA插入片段示意圖

文庫(kù)最終產(chǎn)物質(zhì)控
文庫(kù)制備的最后一步是需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而富集接頭連接的片段，產(chǎn)生足夠的文庫(kù)拷貝用于測(cè)序。良好的質(zhì)控確保了高質(zhì)量的文庫(kù)準(zhǔn)備，確定最終文庫(kù)的大小、濃度和摩爾濃度。

兩大影響因素：
· 接頭二聚體
· 拷貝數(shù)大小

圖 7 使用安捷倫生物分析儀進(jìn)行NGS文庫(kù)QC。(A)高質(zhì)量文庫(kù) (B)接頭二聚體約150bp的例子