2019年12月4號(hào)，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Crystal L. Mackall教授課題組在《Nature》雜志發(fā)表的文章，揭示了CAR-T細(xì)胞中c-Jun過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭抵抗[1]。研究人員構(gòu)建了T細(xì)胞耗竭模型，通過(guò)ATAC-Seq技術(shù)，精確定位調(diào)節(jié)過(guò)表達(dá)或表達(dá)不足的基因組區(qū)域，找到了c-Jun基因。研究人員最終發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)經(jīng)典AP-1因子c-Jun的CAR-T細(xì)胞具有增強(qiáng)擴(kuò)增潛能、減少終末分化和提高抗腫瘤的效力。

 

過(guò)表達(dá)c-Jun的CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞的耗竭抵抗

過(guò)表達(dá)c-Jun的CAR-T細(xì)胞有效地抵抗了耗竭過(guò)程，那么是否會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的殺傷活性呢？研究人員采用了Incucyte® 高通量實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)對(duì)修飾后的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了殺傷活性分析，將GFP+的靶細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞接種于96孔板共培養(yǎng)，每2-3小時(shí)自動(dòng)成像分析。Incucyte® 高通量活細(xì)胞分析系統(tǒng)具有無(wú)需取出細(xì)胞、無(wú)需同位素或抗體標(biāo)記、免清洗、提供圖像證據(jù)等優(yōu)點(diǎn)，因此分析期間不需要進(jìn)行任何的操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)軟件分析的Total integrated GFP intensity進(jìn)行殺傷活性分析。
 

針對(duì)Nalm6靶細(xì)胞CAR-T以及過(guò)表達(dá)c-Jun的CAR-T細(xì)胞都表現(xiàn)出很好的殺傷活性，但是在低表達(dá)靶抗原的Nalm6-F靶細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)c-Jun的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出了更好的殺傷活性。
 

并且在低的效靶比的情況下，過(guò)表達(dá)c-Jun的CAR-T細(xì)胞依然可以維持更好的殺傷活性。并且在后期的小鼠體內(nèi)腫瘤模型也顯示了類似的結(jié)果。該文章利用在體外構(gòu)建的T細(xì)胞耗竭模型，發(fā)現(xiàn)了c-Jun在T細(xì)胞耗竭中的作用，過(guò)表達(dá)c-Jun可以使CAR T細(xì)胞抵抗耗竭，發(fā)揮更強(qiáng)的腫瘤殺傷效果。
 
 

2022年4月27號(hào)，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Crystal L. Mackall教授課題組再次在《Cell》雜志上發(fā)表最新的研究成果[2]，利用FDA已批準(zhǔn)的小分子藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)了可調(diào)控的CAR系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于可抑制蛋白酶進(jìn)行的信號(hào)中和（SNIP），在基礎(chǔ)狀態(tài)下NS3p蛋白酶切割CAR分子使其失活（Off狀態(tài)），SNIP CAR-T細(xì)胞暴露于NS3p抑制劑GPV，NS3p活性被抑制從而阻斷其切割CAR分子，CAR分子的功能不受影響（on狀態(tài)）。
 

SNIP工作機(jī)理

研究人員設(shè)計(jì)了不同版本的SNIP CAR-T細(xì)胞，為了快速準(zhǔn)確地評(píng)估不同版本的CAR-T細(xì)胞的殺傷活性，研究人員同樣使用了Incucyte® 檢測(cè)了SNIP CAR-T針對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性，以及藥物對(duì)SNIP CAR-T細(xì)胞的調(diào)控活性。Incucyte® 的分析結(jié)果顯示SNIP系統(tǒng)在Off狀態(tài)下沒(méi)有明顯的“泄露”活性，在ON狀態(tài)下具有腫瘤殺傷活性且強(qiáng)于組成型的CAR-T細(xì)胞。
 

研究人員結(jié)合了RNA測(cè)序、單細(xì)胞測(cè)序、質(zhì)譜流式等分析手段，發(fā)現(xiàn)在Off狀態(tài)下的CAR-T細(xì)胞一旦被激活具有更強(qiáng)和更快的腫瘤殺傷動(dòng)力學(xué)。并且調(diào)整給藥可調(diào)整SNIP的活性為CAR-T細(xì)胞治療打開了新的治療窗口。多種不同的小鼠模型包括原位實(shí)體瘤模型也證實(shí)了SNIP CAR-T的有效性和安全性。

本研究基于FDA批準(zhǔn)的小分子藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)了SNIP CAR-T平臺(tái)，與傳統(tǒng)的CAR-T平臺(tái)相比具有更好的安全性和有效性。
 
 

 
免疫細(xì)胞腫瘤殺傷活性的體外評(píng)價(jià)過(guò)程涉及到免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞兩種細(xì)胞共培養(yǎng)，因此不能采用傳統(tǒng)的細(xì)胞增殖活性檢測(cè)手段（如MTT、ATP等方法）直接進(jìn)行檢測(cè)。目前常用的免疫細(xì)胞殺傷研究方法包括51鉻釋放試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、3H 胸腺嘧啶和 ATP 檢測(cè)。這些方法步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間和人力，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞之間相互作用的研究。
 

Incucyte® 高通量實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)
 

Incucyte® 位于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，可以長(zhǎng)時(shí)程自動(dòng)采集相差和熒光圖片，實(shí)時(shí)觀察并全自動(dòng)分析腫瘤細(xì)胞殺傷和免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，配合Cell-By-Cell軟件模塊可以自動(dòng)地完成圖片的定量分析，直接測(cè)定腫瘤細(xì)胞的死亡及活力。

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Dr. Anne Lodge
首席科學(xué)家，Cellero（于2020年被Charles River收購(gòu)）
 
 

-參考文獻(xiàn)-