使用序列特異性的CAS內(nèi)切酶進(jìn)行精確性敲除，敲入，替換等已成為一種常用的分子生物學(xué)手段。但是，為了識別所需的基因修飾，排除脫靶克隆，仍然需要篩選幾百個(gè)單克隆細(xì)胞系。而大量克隆的維護(hù)和篩選是一個(gè)費(fèi)力、耗時(shí)、容易出錯(cuò)的過程。

歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）研究人員Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等分享了一種快速驗(yàn)證基因編輯效果的實(shí)驗(yàn)方案。該方案使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)（Crystal Digital PCR™）實(shí)現(xiàn)了一次三色分析就可完成目標(biāo)拷貝數(shù)的評估和脫靶事件的檢測。且基于數(shù)字PCR (dPCR)的高敏感性，無需大量的樣品，因此，在早期就可以完成篩選試驗(yàn)。Crystal Digital PCR™一次實(shí)驗(yàn)3個(gè)小時(shí)內(nèi)就可完成，對于編輯錯(cuò)誤的克隆當(dāng)天就可終止培養(yǎng)。那么這個(gè)實(shí)驗(yàn)具體是怎么設(shè)計(jì)的？就讓我們一起來看看吧。

應(yīng)用亮點(diǎn)：
▶ naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)一次三色分析同時(shí)完成目標(biāo)拷貝數(shù)的評估和脫靶事件的檢測，是非常強(qiáng)大的絕對定量工具。
▶ naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對長插入片段(如mEGFP)拷貝數(shù)提供穩(wěn)健的檢測方法。
▶ naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)只需少量生物樣本，可以在早期完成檢測，快速完成CRISPR篩選，節(jié)省時(shí)間。

Single-step 3-color Crystal Digital PCR™實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

該實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了三個(gè)探針：

1.“total tag”（HEX基團(tuán)標(biāo)記）檢測mEGFP轉(zhuǎn)基因；

2.“on-target tag”（FAM基團(tuán)標(biāo)記）檢測內(nèi)源NUP93編輯位點(diǎn)的最后一個(gè)外顯子與整合的mEGFP轉(zhuǎn)基因(標(biāo)簽)的5'序列之間的連接；

3.reference(CY5基團(tuán)標(biāo)記)作為內(nèi)參，對“total tag”和“on-target tag”進(jìn)行歸一化。“total tag”歸一化獲得整合的mEGFP拷貝數(shù)和“on-target tag”獲得靶標(biāo)上整合的mEGFP拷貝數(shù)。

實(shí)驗(yàn)使用U-2 OS細(xì)胞作為基因編輯對象，其具有3個(gè)NUP93等位基因。

結(jié)果分析：

如圖B所示，對多個(gè)U-2 OS細(xì)胞系的基因編輯效果進(jìn)行分析，naica^®微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)結(jié)果顯示克隆35，52和247的U-2 OS細(xì)胞mEGFP總拷貝數(shù)和靶標(biāo)拷貝數(shù)都為3，這表明這三個(gè)細(xì)胞系的所有3個(gè)NUP93等位基因都成功編輯，沒有脫靶，這個(gè)結(jié)果與檢測金標(biāo)準(zhǔn)的Southern blot的結(jié)果一致（圖C），而克隆5雖然mEGFP總拷貝數(shù)和靶標(biāo)拷貝數(shù)一致，但與NUP93位點(diǎn)的預(yù)期數(shù)量不匹配。這表明其可能發(fā)生基因組的重排，而Southern blot結(jié)果也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象，其出現(xiàn)了一個(gè)小于正常NUP93的拷貝條帶。對于克隆25和246，雖然其靶標(biāo)拷貝數(shù)符合預(yù)期，但是其總拷貝數(shù)大于3，這表明其可能存在脫靶整合或者不完全HDR（homology-directed repair）現(xiàn)象，而Southern blot結(jié)果顯示其存在一個(gè)過大的整合條帶，表示其可能存在基因重排。

上述這些結(jié)果表明基于naica^®微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)（3-color Crystal Digital PCR™）的基因編輯脫靶檢測的三色數(shù)字PCR檢測方法，是一種快速簡便的一步檢測方法，其結(jié)果與耗時(shí)更長的Southern blot技術(shù)完全一致，可以用來快速評估基因編輯效果，篩選適合的基因編輯細(xì)胞株系。