什么是多重PCR？

多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)也稱復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系中加入一對(duì)以上引物，各對(duì)引物分別結(jié)合在模板相對(duì)應(yīng)位置，最終擴(kuò)增出一條以上目的DNA片段(圖1)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。
 

▲ 圖1:多重PCR反應(yīng)示意圖（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
 

熒光定量PCR可以實(shí)現(xiàn)多重PCR嗎？

當(dāng)然是可以的，熒光定量PCR除了常規(guī)的單基因定量外，也是可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)檢測(cè)。單基因檢測(cè)我們一般使用染料法，通過染料分子與雙鏈DNA的結(jié)合來進(jìn)行PCR反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，但是這種結(jié)合是非特異的，我們無法區(qū)分同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中的多個(gè)目的DNA片段，因此需要采用另一種方式來同時(shí)進(jìn)行多基因的檢測(cè)，也就是探針法。
 

▲ 圖2:染料法和探針法的檢測(cè)原理（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

探針法通過與模板特異性結(jié)合的探針解決了特異性的問題，同時(shí)不同的探針可以標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，通過對(duì)不同探針之間的識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的同時(shí)檢測(cè)和定量。但是這又帶來一個(gè)問題，就是在針對(duì)不同基因設(shè)計(jì)探針時(shí)該如何選擇熒光基團(tuán)呢？

在選擇熒光基團(tuán)時(shí)首先要考慮一個(gè)問題，您要使用的儀器所配置的熒光通道是怎樣的，這里就以Azure Cielo™ 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)和Stilla naica^® 6色微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)為例來進(jìn)行說明。

▲ 圖:多重檢測(cè)示意圖（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
 

Azure Cielo™ 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)共有6個(gè)熒光通道，最多可同時(shí)檢測(cè)6個(gè)基因。為什么能同時(shí)檢測(cè)這么多基因呢，這里就要科普一個(gè)小知識(shí)了，那就是熒光是怎么產(chǎn)生的。當(dāng)激發(fā)光照射到熒光基團(tuán)上時(shí)，熒光基團(tuán)就會(huì)發(fā)出發(fā)射光，也就是我們需要的熒光信號(hào)，對(duì)于不同的熒光基團(tuán)，其接收的激發(fā)光和發(fā)射的發(fā)射光波長(zhǎng)都是不一樣的，因此需要根據(jù)機(jī)器的特性進(jìn)行選擇。對(duì)于Azure Cielo™ 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，只要使用的熒光基團(tuán)在6個(gè)通道的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的范圍內(nèi)，都支持使用。其次，Azure Cielo™ 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光檢測(cè)通道的設(shè)計(jì)之初，就是要覆蓋市面上大多數(shù)的熒光基團(tuán)類型，所以基本不需要擔(dān)心探針適配性問題。
 

▲ 圖4:Azure Cielo™ 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光檢測(cè)通道
 

naica^® 6色微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)熒光探針的選擇與Azure Cielo™ 6相似，對(duì)于naica^® 6色微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)而言，其同樣配置有6個(gè)熒光檢測(cè)通道，6個(gè)通道的波長(zhǎng)范圍也基本覆蓋了市面上大部分的熒光基團(tuán)，無需擔(dān)心適配性和選擇問題。
 

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法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。