數(shù)字PCR是第三代PCR技術(shù)，和qPCR技術(shù)相比具有靈敏度高、精準(zhǔn)度高、對抑制劑耐受性更強等優(yōu)勢，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，并可直接對起始核酸進行絕對定量，尤其適用于對低豐度樣品的檢測。目前，數(shù)字PCR在醫(yī)學(xué)、制藥、環(huán)境、食品檢測等多個領(lǐng)域展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。
 

 

集多重優(yōu)勢于一體的數(shù)字PCR實驗該如何實施呢？今天呢，我們就一起來看一下數(shù)字PCR實驗的第一步：模板的制備。
 

圖源：gene-π數(shù)字PCR學(xué)習(xí)網(wǎng)站
 

模板制備是數(shù)字PCR實驗成功的關(guān)鍵一步。模板提取、質(zhì)量控制、避免污染和保存都是模板制備過程中的重要因素。
 

1、清除環(huán)境污染

大多數(shù)Taq聚合酶的敏感性都比較高，一旦存在污染可能會發(fā)生外源DNA擴增并影響整個實驗。而外界環(huán)境中存在多種污染源，因此必須遵守嚴(yán)格的實驗規(guī)程并做好清除污染措施。

為了避免DNA污染，應(yīng)遵循以下常規(guī)PCR建議：

☑   定期使用3%漂白劑溶液和水/乙醇清潔實驗室工作臺和設(shè)備，或根據(jù)應(yīng)用情況使用DNase/RNase；

☑   盡可能將管蓋好；

☑   渦旋后進行離心；

☑   設(shè)置無模板對照。
 

2、模板提取

數(shù)字PCR的DNA和RNA模板提取方法與實驗室中各種提取方法是兼容的，包括苯酚氯仿法,各種試劑盒提取方法。

☑   在提取過程中，盡量簡化步驟，縮短提取時間；

☑   減少化學(xué)因素對核酸的降解；

☑   減少物理因素對核酸的降解，如機械剪切力和高溫；

☑   防止核酸的生物降解。
 

3、質(zhì)量控制

模板提取之后，我們需要對模板的純度和質(zhì)量進行檢測，以保證得到最佳的實驗效果。例如分光光度法可以驗證提取的DNA溶液的良好吸光度(A260/280)的比例。常用的方法還有PicoGreen熒光染料定量檢測、瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管凝膠電泳和3'：5'分析等，盡量避免污染物和潛在抑制劑的存在。

4、保存

提取的DNA模板的存儲也是一個重要的監(jiān)控因素。保存時需要避免核酸降解，如胞嘧啶脫氨和8-Oxo-2'-脫氧鳥苷的形成，因為氧化損傷可能導(dǎo)致在PCR擴增過程中的堿基轉(zhuǎn)位。緩沖液和溫度條件對樣品的質(zhì)量也有影響，一般提取的DNA模板用TE溶解并-20℃保存。
 

除了上述這些，樣本本身固有的其他參數(shù)也可能會對數(shù)字PCR實驗產(chǎn)生影響：

A 、富含GC的模板

因為GC鍵非常穩(wěn)定，如果模板包含富含GC的區(qū)域可能導(dǎo)致模板不能完全擴增。因此，為了使模板獲得更好的變性，可以嘗試在PCR混合物中添加DMSO或甜菜堿。

B、高分子量DNA

與qPCR一樣，模板的復(fù)雜性可能會影響檢測性能，例如質(zhì)粒和長片段基因組DNA。對DNA片段進行限制性酶切可以平衡模板差異，并防止對目標(biāo)分子的低估。但要保證擴增子序列中不能有酶切位點，對已經(jīng)片段化的DNA(例如來自福爾馬林固定、石蠟包埋組織或細(xì)胞游離的DNA)進行酶切可能導(dǎo)致信號丟失。

通常高分子量的DNA或質(zhì)粒作為模板可能會影響陰陽性微滴分區(qū)，建議在進行數(shù)字PCR之前使用化學(xué)或酶切方法進行DNA剪切，而且剪切步驟可以直接在PCR mix中進行。

C、DNA拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)換

在數(shù)字PCR實驗中，需要對模板濃度進行檢測，以避免濃度過高造成檢測結(jié)果飽和（全部都是陽性微滴）。當(dāng)濃度足夠高時，常用的方法如熒光法和分光光度法，可用于定量核酸，從而初步預(yù)估使用數(shù)字PCR的適合測量濃度。值得注意的是，這種方法測量的是組成核酸堿基單位體積的質(zhì)量。因此，使用測量質(zhì)量的方法來確定基因組拷貝數(shù)，需要進行相應(yīng)的換算。當(dāng)以質(zhì)量為基礎(chǔ)的核酸定量與dPCR結(jié)果進行比較時，或從任何用于計算分子拷貝數(shù)的方法中得出的結(jié)果時，必須包括用于計算基因組分子量的清晰描述，以及用于計算該值的方法。

在數(shù)字PCR中，DNA拷貝數(shù)的計算只需要知道被研究基因組的質(zhì)量，然后應(yīng)用以下公式即可：反應(yīng)體積中拷貝數(shù)=反應(yīng)體積DNA質(zhì)量(ng)/研究基因組質(zhì)量(ng) 。

這里還有在線網(wǎng)站供大家參考：http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html

詳情可參考深藍(lán)云公眾號的推文：技術(shù)小站 | 濃度到拷貝數(shù)的換算。

D、逆轉(zhuǎn)錄酶

在逆轉(zhuǎn)錄酶數(shù)字PCR (RT-dPCR)中，RNA轉(zhuǎn)錄本需通過一步法或者兩步法轉(zhuǎn)化為互補DNA (cDNA)進行使用。在一步法中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR均在同一分區(qū)中按順序排列。即使每個RNA分子產(chǎn)生多個cDNA拷貝，結(jié)果也不會被高估。在兩步法中，先進行批量轉(zhuǎn)錄，然后對cDNA進行微滴分區(qū)，在單獨的反應(yīng)中進行dPCR。逆轉(zhuǎn)錄酶的步驟可能是一個主要的錯誤來源，應(yīng)在實驗設(shè)計中考慮。

通過上述的介紹，大家是不是發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR的模板制備并沒有那么復(fù)雜呀，感興趣的小伙伴可以先把模板制備好，然后聯(lián)系我們，趕緊來體驗一下數(shù)字PCR的魅力吧。

 

 

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