單個外泌體表征分析是將免疫學與光學結合的一種新技術^[1]。該技術首先利用免疫識別將特定的外泌體進行捕獲分離，然后再對目標外泌體的表面標志物及內容物（如攜帶的蛋白質、RNA、DNA及細胞因子）進行定量分析，從而更加全面地反映外泌體的特性。作為外泌體表征分析的倡導者，美國NanoView Biosciences于2018年推出了全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)ExoView，該系統(tǒng)一經推出，便引起了外泌體領域科研工作者的廣泛關注，僅兩年在全球已有50多個實驗室采用該技術，發(fā)表文獻近百篇。進入2021年，使用ExoView發(fā)表的論文出現(xiàn)井噴性增長，短短數(shù)月已經發(fā)表了近30篇。本文將選取其中幾篇比較有代表性的文章，來說明ExoView在腎臟再生、胎兒早產、miRNA等研究領域的具體應用。

ACS Nano：多聚脫氧核糖核苷酸和干細胞來源的細胞外囊泡的復合生物活性支架可用于腎臟再生

慢性腎病（CKD）已是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，因為其治療成本高，而且發(fā)病率和患病率在不斷增加。目前CKD的治療方法是腎臟替代療法，包括腹膜透析、血液透析和腎臟移植，但可用腎臟的數(shù)量無法滿足日益增長的需求。因此，腎臟組織工程和腎臟再生被認為是一種有前景的治療方法。基于此，Kyoung-Won Ko等^[2]研發(fā)了一種多孔氣動微擠壓復合支架（PME），它是由聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA, P）、氫氧化鎂（MH, M）和脫細胞豬腎細胞外基質 (kECM, E) 組成，并用多聚脫氧核糖核苷酸（PDRN）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/干擾素-γ（IFN-γ）誘導的間充質干細胞來源的細胞外囊泡（TI-EV）進行功能化，以促進腎組織的再生和維持其功能。結果顯示與現(xiàn)有的腎部分切除小鼠模型的 PME 支架相比，PME/PDRN/TI-EV支架可誘導有效的腎小球再生和腎功能恢復。

其中，研究人員使用ExoView對未處理的臍帶組織間質干細胞的外泌體（UC-EV）和經過TNF-α/IFN-γ 預處理的臍帶組織間質干細胞的外泌體（TI-EV）進行檢測，結果顯示CD9和CD81在UC-EV上顯著表達，而CD63主要在TI-EV 上表達（圖1）。由于CD63對內吞作用很重要，因此TI-EV比UC-EV更容易被細胞攝取。

圖1   ExoView檢測CD9、CD63、CD8在UC-EV和TI-EV中的表達

Lab on a Chip：細胞外囊泡介導的母胎之間HMGB1信號誘導早產

早產（PTB，小于37周的妊娠）每年影響了全球約11％的孕婦，造成100萬新生兒的死亡。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種警報素，是衰老羊膜細胞通過細胞外囊泡釋放的炎癥信號之一。羊水、臍帶血和孕婦血液中的HMGB1水平升高與足月和早產有關。Enkhtuya Radnaa等^[3]通過電穿孔把正常羊膜上皮細胞的外泌體改造為含有HMGB1的外泌體（eHMGB1）并對其進行表征，然后使用包含四個不同細胞類型（羊膜、絨毛膜間充質、絨毛膜滋養(yǎng)層和蛻膜細胞）的四腔微流控芯片器官設備（FMi-OOC）測試其在母-胎界面（FMi）中的傳播力。結果顯示導致PTB的eHMGB1與增加的FMi炎癥有關。該研究證明了胎兒外泌體介導的旁分泌信號傳導可以產生炎癥并誘導分娩。

值得注意的是，研究人員對eCTRL與eHMGB1進行熒光染色標記并使用ExoView進行檢測�；�于ExoView可有效檢測外泌體內容物的特性，研究結果顯示eHMGB1的HMGB1陽性外泌體數(shù)量明顯高于eCTRL，而CD9和 CD63陽性的外泌體在兩個樣本中數(shù)量接近，這表明HMGB1已成功裝載到eHMGB1中（圖2）。

圖2   ExoView檢測改造的對照外泌體（eCTRL）與eHMGB1

Brain Behavior and Immunity：脊髓損傷導致血清神經炎癥相關納米顆粒中miRNA與CD81+外泌體水平的改變

脊髓損傷（SCI）會對機體產生系統(tǒng)性影響，導致呼吸、免疫、消化等功能異常，以及相關腦區(qū)產生神經炎癥和退行性病變。有研究表明，SCI的病理發(fā)展可能與血液中外泌體的運輸有關；而在中樞神經系統(tǒng)損傷模型中，外泌體可能參與了miRNA等炎性因子運輸導致炎癥擴散。Khan等^[4]使用包括Exoview外泌體表型分析的多種技術詳細表征了SCI建模的小鼠血漿外泌體，發(fā)現(xiàn)損傷后外泌體的數(shù)量、蛋白marker和內容物均有明顯的變化，將SCI小鼠的外泌體注射入腦室還可誘發(fā)產生炎癥。

研究人員使用ExoView檢測了SCI血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強度和共定位（圖3A）。外泌體在CD81和CD9區(qū)域產生特異性結合而被捕獲，而沒有CD63捕獲。根據干涉成像獲得外泌體尺寸分布，其中在50nm最多（圖3B&C）。熒光成像則檢測到了大量干涉成像檢測不出的尺寸小于50nm的外泌體（圖3D&E），CD81和CD9在大量外泌體上表型出熒光共定位，而CD63熒光則未被檢測到，這與圖3C結果一致（圖3F-H）。

圖3   ExoView檢測血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強度和共定位

研究人員進一步比較了SCI組和對照組的血漿外泌體變化，結果表明，在損傷后1d的時間點，CD81外泌體數(shù)量相對對照組更高，與Western Blot的結果一致；而CD9外泌體數(shù)量則沒有統(tǒng)計學差異，與流式分析的結果一致（圖4A&B）。基于圖3H的CD81與CD9有大量的熒光共定位，檢測CD9外泌體的CD81熒光強度，由1d的熒光強度中位數(shù)差異可知，CD81+外泌體數(shù)量與外泌體的CD81含量在損傷后1d有明顯上升（圖4C）。

圖4   ExoView檢測血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強度和共定位

參考文獻：

[1] Scherr, S. M., Daaboul, G. G., Trueb,   J., Sevenler, D., Fawcett, H., Goldberg, B., ... & Ünlü, M. S. (2016). Real-time capture and   visualization of individual viruses in complex media. ACS nano, 10(2),   2827-2833.

[2] Kyoung-Won Ko, So-Yeon Park, Eun Hye   Lee, Yong-In Yoo, Da-Seul Kim, Jun Yong Kim, Tae Gyun Kwon and Dong Keun Han.   (2021). Integrated Bioactive Scaffold with Polydeoxyribonucleotide and Stem-Cell-Derived Extracellular Vesicles for Kidney Regeneration. ACS Nano,   15(4): 7575−7585.

[3] Enkhtuya Radnaa, Lauren S.   Richardson, Samantha Sheller-Miller, Tuvshintugs Baljinnyam, ...& Ramkumar   Menon. (2021). Extracellular vesicle mediated feto-maternal HMGB1 signaling   induces preterm birth. Lab on a Chip, DOI: 10.1039/D0LC01323D.

[4] Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel,   R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2021). Spinal cord injury   alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular   nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and   immunity, Volume 92: 165-183.

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡介

Nanoview所開發(fā)的全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）采用單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術，是一款無需純化的全自動的新型外泌體表征設備。該設備能夠提供全方位的外泌體表征信息，包括顆粒大小、計數(shù)、表型與生物標志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測量解決方案。

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