自從引入聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法 (ART) 以來(lái)，HIV-1感染已從一種致命疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N可控制的慢性疾病。然而，雖然ART可有效抑制個(gè)體的病毒復(fù)制，但它并不能治愈HIV-1感染。這是由于患者體內(nèi)存在一個(gè)潛伏病毒庫(kù)（latent resservoir），其中包含一小部分具有復(fù)制能力的完整原病毒（約占1-5%），在ART停止后為病毒復(fù)制提供“燃料”。因此，科學(xué)家若想通過(guò)消除該病毒庫(kù)達(dá)到HIV-1治愈的目的，就不得不對(duì)這些完整原病毒進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。但是，接受ART治療的患者可能具有載量非常小的完整潛伏病毒庫(kù)，在有限的血液采樣中進(jìn)行檢測(cè)，可能會(huì)遺漏這些潛在儲(chǔ)庫(kù)。

▲圖源：網(wǎng)絡(luò)（侵刪）

在過(guò)去的幾年里，已經(jīng)出現(xiàn)了幾種基于PCR與二代測(cè)序 (NGS) 相結(jié)合來(lái)檢測(cè)病毒庫(kù)的方法。比如基于雙重dPCR方法來(lái)量化HIV-1患者的完整原病毒，即IPDA（intact proviral DNA assay）方法，該方法通過(guò)雙重實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV-1基因組中的PSI和ENV兩個(gè)靶點(diǎn)。另一種常見(jiàn)方法是Q4PCR，其在HIV-1全長(zhǎng)測(cè)序方案中引入了四重qPCR，在全長(zhǎng)測(cè)序之前評(píng)估HIV-1基因組的完整性。盡管這些方法提高了檢測(cè)靈敏度并且可以提供全長(zhǎng)的 HIV-1序列，但其成本效益不高，需要多步人工操作且耗時(shí)較長(zhǎng)。

比利時(shí)根特大學(xué)、根特大學(xué)數(shù)字PCR聯(lián)盟、艾滋病毒治療研究中心等科學(xué)家近日在知名期刊《Methods》上發(fā)表了一篇HIV-1病毒庫(kù)研究相關(guān)文獻(xiàn)，文章對(duì)IPDA方法和Q4PCR方法進(jìn)行集成，并在naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，該方法增加了IPDA 方法檢測(cè)HIV-1的靶點(diǎn)數(shù)量，提高了檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)對(duì)潛伏病毒庫(kù)的精準(zhǔn)定量。

研究方法：

結(jié)合IPDA和Q4PCR方法，設(shè)計(jì)基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的三重?cái)?shù)字PCR實(shí)驗(yàn)。

☑ PSI靶點(diǎn)-FAM藍(lán)色探針標(biāo)記

☑ ENV靶點(diǎn)-HEX綠色探針標(biāo)記

☑ GAG靶點(diǎn) & POL靶點(diǎn)-Cy5紅色探針標(biāo)記

▲ 靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因組位置圖

研究結(jié)果：

☑ 使用J-Lat 8.4細(xì)胞系（每個(gè)細(xì)胞含有1拷貝的HIV-1基因組）進(jìn)行單重實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)三重試驗(yàn)的性能，結(jié)果顯示定量結(jié)果和理論值一致，重復(fù)性好；各靶標(biāo)陰陽(yáng)性微滴區(qū)分良好。

▲ 對(duì)陽(yáng)性對(duì)照J(rèn)-Lat 8.4細(xì)胞的拷貝數(shù)進(jìn)行量化-設(shè)定PSI、ENV、GAG/POL單重檢測(cè)

及IPDA和三重等多重實(shí)驗(yàn)，并對(duì)DNA剪切情況進(jìn)行校正（DSI）

☑ 使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)直接定量來(lái)自HIV-1患者的五個(gè)PBMC樣本，這些樣本病毒載量較低，且均經(jīng)過(guò)ART治療，檢測(cè)結(jié)果顯示5個(gè)患者均檢出了HIV-1。此外，發(fā)現(xiàn)一個(gè)比較有趣的現(xiàn)象，在患者SLR_26樣本中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到ENV且PSI也只有非常低的信號(hào)，該結(jié)果表明PSI和ENV序列中可能存在缺失或突變，如果只檢測(cè)這兩個(gè)靶點(diǎn)的話(huà)，該病人可能被判讀為HIV-1陰性。幸運(yùn)的是，使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)設(shè)計(jì)的三重實(shí)驗(yàn)，GAG或POL基因正常檢出，表明該樣本含有HIV-1。
 

▲ 使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)5個(gè)HIV-1病人的PBMC(每百萬(wàn)個(gè))進(jìn)行定量

文章結(jié)論：

通過(guò)naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)HIV-1患者潛伏病毒庫(kù)進(jìn)行了量化，相較于傳統(tǒng)方法增加了亞基因組區(qū)域的檢測(cè)數(shù)量，提高了對(duì)潛伏病毒庫(kù)的檢測(cè)的靈敏度，降低結(jié)果誤判的可能性，且該方法甚至可以在未來(lái)開(kāi)發(fā)的5色或6色的數(shù)字PCR系統(tǒng)中進(jìn)一步放大。

原文鏈接如下：https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.05.006

單位簡(jiǎn)介：

根特大學(xué)（Ghent University），簡(jiǎn)稱(chēng)UGent，由荷蘭國(guó)王威廉一世于1817年創(chuàng)辦，迄今已有200多年歷史，是比利時(shí)學(xué)術(shù)排名第一的世界頂尖研究型大學(xué)，一直以其極高的學(xué)術(shù)水平享譽(yù)全球，2020年世界大學(xué)學(xué)術(shù)排名中位列第66名，根特大學(xué)校友中誕生了4位諾貝爾獎(jiǎng)得主。

隨著數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展，根特大學(xué)已成立數(shù)字PCR聯(lián)盟，該聯(lián)盟致力于開(kāi)發(fā)數(shù)字PCR檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析工具，同時(shí)該平臺(tái)還會(huì)不定期舉辦數(shù)字PCR培訓(xùn)課程，幫助廣大學(xué)子及專(zhuān)業(yè)人士更好的了解和應(yīng)用數(shù)字PCR技術(shù)。

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。該系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數(shù)字PCR過(guò)程的耗材。樣品通過(guò)毛細(xì)通道網(wǎng)格以30,000個(gè)微滴的形式進(jìn)入2D芯片中。3色熒光檢測(cè)儀器，整個(gè)流程只需要2.5小時(shí)，并可進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和結(jié)果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。