多重分析，即在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)，可以幫助用戶節(jié)省寶貴的樣品，并節(jié)省時(shí)間、試劑和成本。此外，和做多次單重實(shí)驗(yàn)相比，由于多重反應(yīng)所有靶標(biāo)都在同一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，使得樣品和試劑的移液操作誤差減少，因此多重檢測(cè)可以提高定量精度。naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測(cè)與單重檢測(cè)一樣靈敏和精準(zhǔn)。專業(yè)的分析設(shè)計(jì)和優(yōu)化可以實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的多重檢測(cè)，從而在單個(gè)PCR反應(yīng)中用多對(duì)引物和探針擴(kuò)增多個(gè)DNA目標(biāo)。Crystal Miner軟件是一個(gè)開(kāi)放的數(shù)據(jù)分析軟件，可以通過(guò)其提供的強(qiáng)大工具來(lái)幫助優(yōu)化和完成多重分析。
 

評(píng)估引物和探針性能的實(shí)驗(yàn)指南

1.Stilla建議使用naica^® multiplex PCR mix，該試劑設(shè)計(jì)的初衷是為了得到更好的多重naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.單重反應(yīng)測(cè)試。在進(jìn)行多重反應(yīng)之前，每個(gè)引物/探針/模板均需要進(jìn)行單重性能驗(yàn)證。例如，對(duì)于三重分析，在多重反應(yīng)混合進(jìn)行之前，首先應(yīng)對(duì)核酸靶標(biāo)進(jìn)行三個(gè)單重反應(yīng)。當(dāng)進(jìn)行單重反應(yīng)時(shí)，預(yù)期結(jié)果只出現(xiàn)單一陽(yáng)性。

3.為了優(yōu)化多重分析性能，樣品性質(zhì)也是十分重要的因素(例如，游離DNA和基因組DNA需要設(shè)計(jì)不同的DNA片段，分析游離DNA需要設(shè)計(jì)成短片段DNA，分析基因組DNA需要設(shè)計(jì)更完整的DNA片段)。

4.使用的DNA模板應(yīng)該沒(méi)有污染物和可能的抑制劑。如果樣品材料稀少或不容易獲得，可以合成寡核苷酸作為模板分析優(yōu)化。

5. 評(píng)估每個(gè)單重反應(yīng)的退火溫度范圍，在最佳反應(yīng)溫度下，陽(yáng)性和陰性微滴分離良好且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增(圖1)。由Crystal Miner軟件(圖2)提供的Stilla可分離評(píng)價(jià)可以作為一種度量標(biāo)準(zhǔn)，用于確定所有探針的最佳退火溫度。如果單重反應(yīng)沒(méi)有被很好地優(yōu)化，可能會(huì)出現(xiàn)明顯的非特異性擴(kuò)增。此外，非特異性擴(kuò)增可能由幾個(gè)非優(yōu)化參數(shù)造成。包括引物/探針二聚體或引物/探針?lè)翘禺愋�。在這種情況下，可以采用多種方法限制非特異性序列的擴(kuò)增，如提高退火溫度、進(jìn)行touch down PCR或重新設(shè)計(jì)引物序列等。實(shí)驗(yàn)前可使用相關(guān)軟件評(píng)估引物探針的特異性。

▲圖1 ：Crystal Miner軟件展示單重反應(yīng)一維點(diǎn)狀圖，在60°C到65°C退火溫度內(nèi)， 藍(lán)色、綠色和紅色熒光通道檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度。黑框部分表示單重反應(yīng)的最佳退火溫度。可分性評(píng)分(e)可用于確定3個(gè)靶標(biāo)擴(kuò)增的最佳退火溫度。(帶*數(shù)字為可分性評(píng)分)
 

▲圖2 ：可分性評(píng)分是基于陽(yáng)性和陰性微滴群體的距離�？煞中栽u(píng)分是由Crystal Miner軟件自動(dòng)計(jì)算，并可以在高級(jí)QC標(biāo)簽欄下找到。
 

6.在選定的退火溫度下，使用所有引物和探針進(jìn)行多重naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，并以區(qū)分度為指導(dǎo)，評(píng)估反應(yīng)性能。如果有需要，可從以下幾點(diǎn)優(yōu)化:

★ 調(diào)整PCR的循環(huán)數(shù)——建議從45個(gè)循環(huán)開(kāi)始，并增加循環(huán)數(shù)，以進(jìn)一步優(yōu)化陽(yáng)性和陰性微滴群體之間的分離度。

★ 調(diào)整引物和探針濃度——naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)推薦的引物和探針濃度范圍可從0.125到1μM (圖3)。對(duì)于多重分析的設(shè)計(jì)建議從較低的濃度范圍開(kāi)始,以減少反應(yīng)的復(fù)雜性,減少引物和探針?biāo)�占�?jù)的體積。
 

▲圖3。Crystal Miner軟件的一維點(diǎn)狀圖顯示了一系列引物(左圖)和探針(右圖)濃度不斷增加時(shí)藍(lán)色檢測(cè)通道中的熒光強(qiáng)度。黑框部分表示良好的可分性評(píng)分，及在低引物探針濃度的選擇標(biāo)準(zhǔn)下確定的用于多重分析的引物探針濃度。(帶*數(shù)字為可分性評(píng)分)
 

★ 使用修飾的堿基，如鎖核苷酸(LNA)堿基或小溝結(jié)合基團(tuán)(MGB)，以提高探針的Tm值，同時(shí)保持較短的長(zhǎng)度(可能<20nt)。然而，在多重檢測(cè)中建議探針添加的MGB不超過(guò)2個(gè)，以避免擴(kuò)增減少。

7.評(píng)價(jià)引物和探針的相互作用：在同一個(gè)多重實(shí)驗(yàn)中引物和/或探針之間形成同源/異源二聚體的概率應(yīng)保持在最低。二聚體是可以評(píng)估的，相互作用的分?jǐn)?shù)可以用多種工具來(lái)確定(例如，IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (圖4)。高濃度的引物和探針會(huì)增加非特異性相互作用的概率。因此，多重分析時(shí)，建議所有檢測(cè)都從低濃度的引物開(kāi)始(例如，0.25 uM)，如果需要，逐步增加濃度至1 uM(例如，提高擴(kuò)增效率)。
 

▲圖4：引物和探針之間的相互作用示例。a)target 1的探針與target 2的反向引物相互作用(R2 target 2，紅框)。當(dāng)使用反向引物RI target 2時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到這種相互作用。在本例中，應(yīng)選擇RI target 2進(jìn)行多重檢測(cè)。b) target 1的探針與target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 藍(lán)框)。當(dāng)使用正向引物F1 target 2時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到這種相互作用。在本例中，F(xiàn)I target 2應(yīng)被選擇用于多重檢測(cè)。
 

8.對(duì)于多重分析，熒光溢出補(bǔ)償是十分重要的。使用多個(gè)單色參照，Crystal Miner軟件可以創(chuàng)建一個(gè)補(bǔ)償模型用于特定的多重反應(yīng)。有關(guān)熒光溢出的更詳細(xì)描述,請(qǐng)?jiān)L問(wèn)https://www.gene-pi.com/item/spill-over-2/。執(zhí)行熒光溢出補(bǔ)償?shù)牟僮髡f(shuō)明請(qǐng)參考Crysta Miner軟件用戶手冊(cè)。
 

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，以Sapphire芯片（全自動(dòng)）或Opal（高通量）芯片為耗材，形成25,000-30,000個(gè)微滴的2D陣列，以單層平鋪方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)完成后對(duì)微滴進(jìn)行三色通道或六色通道檢測(cè)，從而對(duì)起始核酸濃度進(jìn)行絕對(duì)定量。2.5小時(shí)內(nèi)，可快速獲得結(jié)果。