數(shù)字PCR

先進(jìn)的數(shù)字PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了樣品中的單分子核酸擴(kuò)增，從而使的DNA定量的精準(zhǔn)度提高到了全新水平。Philip與Stilla Technologies的首席執(zhí)行官兼聯(lián)合創(chuàng)始人Rémi Dangla進(jìn)行了交流，討論了數(shù)字PCR技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)展和挑戰(zhàn)。

Stilla Technologies公司總部位于法國(guó)巴黎，成立于2013年，生產(chǎn)和銷(xiāo)售高精準(zhǔn)度的DNA定量和檢測(cè)的數(shù)字PCR系統(tǒng)。

“當(dāng)我創(chuàng)立公司時(shí)，從未做過(guò)PCR，”Dangla說(shuō)。 “但我了解了數(shù)字PCR技術(shù)之后，馬上就被這個(gè)設(shè)計(jì)巧妙的技術(shù)所吸引。”

與之前的PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR是可以顯著提高DNA定量的精準(zhǔn)度的一種新技術(shù)。

“數(shù)字PCR技術(shù)為PCR技術(shù)在檢測(cè)稀有突變或低濃度靶標(biāo)基因方面的應(yīng)用，賦予了無(wú)與倫比的數(shù)據(jù)可靠性”Dangla說(shuō)。

數(shù)字PCR反應(yīng)，不是傳統(tǒng)式的混好PCR mix后直接擴(kuò)增，而是將樣品被分散到數(shù)萬(wàn)個(gè)微小的液滴后，進(jìn)行PCR反應(yīng)�？茖W(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)特異性的探針，只識(shí)別與序列相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)基因，產(chǎn)生熒光信號(hào)，數(shù)字PCR系統(tǒng)自動(dòng)數(shù)出含有陽(yáng)性信號(hào)的微滴。

“這樣的技術(shù)可以從100,000個(gè)野生型DNA分子中檢測(cè)出一個(gè)突變分子，甚至是突變體只發(fā)生單堿基改變，也能被檢測(cè)到。在使用之前的PCR技術(shù)進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)分析時(shí)，得到的結(jié)果是錯(cuò)誤的。”Dangla說(shuō)。

實(shí)際上很早就有人提出了數(shù)字PCR的想法，“文獻(xiàn)可追溯到90年代初”Dangla說(shuō)。

當(dāng)時(shí)的困難在于如何實(shí)現(xiàn)同時(shí)分析這么小的體積、且數(shù)量這么多的微滴。Dangla找到了解決這個(gè)困難的方法，將微流控技術(shù)和芯片技術(shù)結(jié)合，最大程度的簡(jiǎn)化了微滴的生成和分析。

Dangla認(rèn)為數(shù)字PCR技術(shù)最具潛力的應(yīng)用之一是只需少量血液樣品即可進(jìn)行癌癥診斷，也就是液體活檢技術(shù)。

“在嘗試使用血液樣本，進(jìn)行血液樣本中的ctDNA檢測(cè)時(shí)，就類(lèi)似大海撈針，”他解釋道。 “數(shù)字PCR技術(shù)是唯一可以檢測(cè)血液中的ctDNA分子并獲得可靠結(jié)果的解決方案。”

例如，數(shù)字PCR特別有助于檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)治療中產(chǎn)生耐藥性的突變，從而指導(dǎo)醫(yī)生用藥，更換治療效果更好的其他藥物。

數(shù)字PCR技術(shù)的潛在應(yīng)用方向吸引了許多參與者進(jìn)入日益增長(zhǎng)的數(shù)字PCR市場(chǎng)，從2011年到現(xiàn)在增長(zhǎng)數(shù)百萬(wàn)歐元。最早是Fluidigm公司，它于2006年發(fā)布了第一款產(chǎn)品，Bio-Rad現(xiàn)在以更低的價(jià)格占有最大市場(chǎng)份額。 Stilla Technologies公司的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)市場(chǎng)上最簡(jiǎn)單，最快速的數(shù)字PCR技術(shù)，目前在這一領(lǐng)域已占有重要位置。

但仍然需要克服一些挑戰(zhàn)，其中之一就是定價(jià)。 Dangla說(shuō)數(shù)字PCR不可能完全取代前幾代PCR技術(shù)。到目前為止，數(shù)字PCR價(jià)格偏貴，僅被用于更具意義的應(yīng)用中。

隨著技術(shù)的發(fā)展，成本問(wèn)題即可解決，Dangla認(rèn)為在精準(zhǔn)DNA定量方便有個(gè)重要的但是被忽視了就是樣品制備。本質(zhì)上講，就是數(shù)字分析前的DNA提取步驟。

“我們現(xiàn)在知道有關(guān)患者的所有信息都存在于含有一些稀有的生物標(biāo)記物的10mL血液中。 現(xiàn)在的困難不是在分析系統(tǒng)中找到這些生物標(biāo)記物;  DNA分子在芯片中，那就會(huì)被找到，會(huì)被檢測(cè)到”Dangla說(shuō)。

“困難在于如何在10mL中提取到DNA分子，并確保在20μL體系中能夠檢測(cè)和分析到。 這是一個(gè)取樣問(wèn)題。“

隨著上個(gè)月的首次融資活動(dòng)結(jié)束，Stilla正在考慮擴(kuò)大其數(shù)字PCR系統(tǒng)的銷(xiāo)售，并將開(kāi)展Naica數(shù)字PCR系統(tǒng)在臨床的應(yīng)用，首先將從實(shí)現(xiàn)癌癥患者液體活檢樣本的分析開(kāi)始。

除腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用外，數(shù)字PCR還應(yīng)用在很多其它領(lǐng)域中，如轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，制藥公司的質(zhì)量控制、伴隨診斷等。隨著數(shù)字PCR技術(shù)變得越來(lái)越精確，和成本的降低，這項(xiàng)DNA定量的新生技術(shù)將會(huì)越來(lái)越廣泛。