（一） Alveole PRIMO 的原理

定制細胞模型， 研究微環(huán)境對細胞內(nèi)和細胞間機能的影響是細胞和醫(yī)學研究的重要方
向。 如何制備出具有可控性和重復性的微環(huán)境， 以便更有效的研究活細胞和疾病模型， 一直
以來都是生物學家進行體外細胞研究所面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。

法國 Alveole PRIMO “定制化細胞微環(huán)境制備系統(tǒng)” 是創(chuàng)新性定制細胞模型的工具，
能在微米級別的尺度下， 以具有超高靈活度和再現(xiàn)性的生物工程手段實現(xiàn)體外微環(huán)境的定
制， 同時可對其機械力學和生化特性進行設計微調(diào)。 圖 1. 左圖： 選擇電腦中任意一張圖案， 在 LEONARDO 軟件作用下， 用 PRIMO 進行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數(shù)倒置顯微鏡兼容。 右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（Digital Micromirror Device） ， 即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態(tài)， 控制投射在細胞
基質(zhì)上的紫外激光的照射強度、 照射時間和照射區(qū)域， 按照圖案進行靈活蝕刻【1】 。
  圖 2. PRIMO 有三種設計方法： （1） 基質(zhì)的表面功能化（Micropatterning） ： 適用于細胞
微環(huán)境研究； （2） 水凝膠的結構化： 適用于 3D 細胞培養(yǎng)； （3） 微制造（Microfabrication）：適用于制造微流控芯片【1】 。
我們先探討第一種設計： 基質(zhì)的表面功能化（Micropatterning） ， 可建立生物模型， 實現(xiàn)
體外微環(huán)境的定制， 同時對其機械力學和生化特性進行設計微調(diào)。 圖 3. 第一種設計： 基質(zhì)的表面功能化（Micropatterning） 。 先在基質(zhì)上包裹一層防污涂
層（ antifouling layer） ， 阻礙蛋白質(zhì)粘附。 PRIMO 利用非接觸式、 無掩模的光刻技術，
用 UV 光將圖案投射到細胞基質(zhì)上， 在 PLPP 光敏引發(fā)劑幫助下， 防污涂層被降解， 蝕刻出微
圖案， 蛋白可粘附在蝕刻出的微圖案上， 細胞粘附在蛋白上， 可適應于基質(zhì)上定制的生物化
學、 表面形貌和硬度等特征， 形成定制的細胞模型。 適用于細胞微環(huán)境研究【1】 。

（二） PRIMO 的主要特點和優(yōu)勢【1】 ：

 無掩模： 非接觸式、 無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm） ， 可靈活控制 UV 的強度、 照
射時間、 區(qū)域；
 自動化： 全自動快速定制， 可針對實驗條件進行快速優(yōu)化；
 高靈活性： 可按照任意圖案去構建您的基質(zhì)和/或使其功能化， 不限圖案的大小和復雜
程度， 生成不同的細胞模型；
 多樣性/兼容性： 適用于常規(guī)的細胞培養(yǎng)基質(zhì)， 基質(zhì)可為平面或有微結構， 可硬可軟，
如： 玻璃蓋玻片、 塑料培養(yǎng)皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝膠（PEG 丙
烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂、 基質(zhì)膠） 、 光刻膠， 等；
 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體， 等；
 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物鏡） ；
 多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次， 粘附不同密度層次的蛋白；
 多種蛋白： 可應用 3 種不同蛋白（根據(jù)實驗需求） ；
 自動對齊： 自動進行檢測和圖案定位， 可自動對齊于微結構或者微圖案上；
 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡， 僅需 30s。

（ 三） 應用舉例：

（ 1） 研究細胞間作用力 圖 4. 為檢測氣道平滑�。ˋSM） 細胞是如何互相作用并與細胞外基質(zhì)（ECM） 作用的， 用 PRIMO設計了一個長方形結構， 將兩個細胞組合在一起【 2】 。 圖 A： 剛度為 E=300Pa 的基質(zhì)可用來模擬健康的人氣管的細胞外基質(zhì)（ ECM） ， 此時 ASM 細胞形成穩(wěn)定的細胞-細胞連接， 交界處清楚地顯示紅色的β -連環(huán)蛋白（ 細胞-細胞間粘附連接（ adherens junction)的標志物，
紅色） 。 （ B-C） ： 重新建模的剛性更強的 ECM， E =13kPa-40kPa， 當 ECM 剛性增強到 13kPa時， 可以看出細胞交界處出現(xiàn)了綠色的黏著斑蛋白（ 細胞-ECM 間黏著斑連接(focal adhesion)的標志物， 黃色箭頭） 。 當 ECM 剛性增強到 40kPa 時， 細胞交界處的β -連環(huán)蛋白（ 紅色）讓位給了黏著斑蛋白（ 綠色， 黃色箭頭） ， 說明平滑肌力從“細胞-細胞之間傳導” 變成了“通過 ECM 傳導” 。
PRIMO 作用： 在聚二甲基硅氧烷（ PDMS） 軟基質(zhì)上進行 Micropatterning 設計， 粘附明膠和
ECM 蛋白， 再種上 ASM 細胞創(chuàng)建兩個平滑肌細胞的作用力模型， 通過牽引力顯微鏡研究基質(zhì)
的剛性如何影響平滑肌細胞間的力的傳導（ ECM 剛度是一個開關， 可以調(diào)控平滑肌力是“ 通
過 ECM” 傳導的， 還是“通過細胞-細胞之間的聯(lián)系” 傳導的） 。

（ 2） 觀察心肌細胞的收縮 圖 5. 左列圖： 心肌細胞在玻璃培養(yǎng)皿上的收縮； 中列圖： 沿著小箭頭方向收縮； 右列圖：
收縮力的顯示【3】 。

PRIMO 實驗： 在玻璃培養(yǎng)皿上， 先加上聚-L-賴氨酸接枝聚乙二醇（PLL-g-PEG） ， 再加 PLPP
光引發(fā)劑， 用 PRIMO 對 PLL-g-PEG 進行蝕刻， 粘附上纖維連接蛋白（fibronectin） 和纖維
蛋白原（fibrinogen） ， 最后加上斑馬魚的心肌細胞， 進行 STORM 成像。 哈佛醫(yī)學院的
Schaibble 等人觀察到?jīng)]有進行 micropatterned 的細胞收縮不佳， 且以異步（不同時） 方
式進行， 而 micropatterned 的細胞則表現(xiàn)出更高且更同步的收縮力。 值得注意的是， 他們
觀察到細胞強度收縮時的 L/ I 比值。 心肌細胞收縮的基本單位是肌原纖維節(jié)組
織（sarcomere） 。 Bray 等人在研究微圖像（micropatterns） 上的單個細胞時發(fā)現(xiàn)， 肌原
纖維節(jié)在拉長的細胞內(nèi)排列更整齊。

PRIMO 作用： 將細胞組成不同的圖像： 四方形、 長條形， 等。 組成圖像的心肌細胞的力學輸
出增加， 微圖像促進了協(xié)作的心肌細胞的收縮。

（3） 研究邊界條件對細胞遷移的影響


圖 6.研究細胞形態(tài)和遷移速度如何受到細胞側向限制的影響【4】 。
PRIMO 實驗： 用 Micropatterning 設計出 5 個連接的不同寬度的微通道， 通道寬度分別是：
5, 9, 13, 17 and 21 µm， 總長度是 320 µm， 細的部分連接到一個直徑 50 µm 的圓盤。 研
究細胞在微通道里的遷移過程。

PRIMO 作用： 用微通道對細胞進行側向限制， 對細胞施加不同的限制力， 這種限制作用可調(diào)
節(jié)三維的細胞形態(tài)并影響細胞遷移速度。 用來模擬上皮組織中 follower cell 形成的空間
限制作用， PRIMO 可加速設計過程。

（4） 研究細胞的趨觸性 圖 7. 研究不同粘度的基質(zhì)誘導 T 細胞的趨觸性： 在不同的粘附條件下， T 細胞在 ICAM-1
基質(zhì)上的運動軌跡【5】 。

細胞趨觸性： 定向遷移是細胞運動的關鍵形式， 主要分為趨化性、 趨觸性和趨硬性三種； 趨
觸性指細胞對微環(huán)境中固定的化學梯度的響應， 如細胞具有應答黏著梯度的運動現(xiàn)象。
（A） ： 負控制基質(zhì)， 0%的粘附對比， 沒有整聯(lián)蛋白（integrin） 條帶， 細胞隨機向不同的
方向遷移。
（B） ： 正控制基質(zhì)， 100%的粘附對比， 整聯(lián)蛋白濃度高， 細胞傾向于在整聯(lián)蛋白條帶上（藍
色垂直象限里） 進行趨觸性遷移。
（C） ： 50%的粘附對比， 整聯(lián)蛋白濃度低， 細胞傾向于在整聯(lián)蛋白條帶上（藍色垂直象限里）
進行趨觸性遷移， 具有介于負控制基質(zhì)和正控制基質(zhì)之間的中間的各向異性指數(shù)。
（A-C） ： 不同顏色表示細胞的運動軌跡。


圖 8. 在不同的粘附條件下， T 細胞在 ICAM-1 基質(zhì)上的遷移特性【5】 。
（A-C） ： 解釋同圖 7： 灰色為細胞， 紅色為整聯(lián)蛋白條帶， 綠色為細胞黏附的足跡。
PRIMO 作用： 用 Micropatterning 方法在 ICAM-1 基質(zhì)上創(chuàng)造出不同濃度的整聯(lián)蛋白的條帶，
改變 ICAM-1 基質(zhì)的粘附性， 觀察細胞在條帶上的遷移（趨觸性） 。
（5） 2D/3D 單個細胞的標準化培養(yǎng)
、 左圖： 隨機地種植細胞；
右圖： 微孔內(nèi)壁進行 Micropatterning（功能化） 后， 可以標準化種植細胞， 使細胞在孔內(nèi)
呈現(xiàn)一致的形狀。

左上圖： 細胞種在沒有包被的微孔中；
右圖： 包含 1080 個微孔（直徑 60um， 高 30um） 的共聚焦圖像， 微孔的底部和內(nèi)壁粘附有纖
維連接蛋白（fibronectin） -羅丹明， HFF 細胞（human foreskin fibroblasts， 人包皮成
纖維細胞） 在微孔中培養(yǎng) 1 天， 進行 TRITC 染色以顯示細胞形態(tài)。
左下圖： 放大圖， 共聚焦圖像和相差圖像重疊， 對 80%的粘附在圖案上的細胞， 50%有合適
的 3D 結構以進行分析。

PRIMO 作用： 當沒有用 PRIMO 時， 細胞在微孔中有不同的形態(tài)， 無法對細胞進行標準化研究；
當用 PRIMO 進行 micropatterning 時， 細胞在微孔中受到控制， 實現(xiàn)標準化培養(yǎng)， 因此可以
對多個細胞進行數(shù)據(jù)獲取， 進行高通量研究。

（ 6） 粘附多種蛋白

圖 11.用 3 色熒光顯微鏡圖像重現(xiàn)的彩色的微米級名畫： “ the Birth of Venus by
Botticelli” 【 8】 。 這幅復雜的微米級圖案由 3 種不同的熒光分子（ GFP、 Pll-g-PEG-TRITC
和 Neutravidin-Ato647） 組成， 這 3 種分子依次序印刷在蓋玻片上， 比例尺為 50µm。
PRIMO 實驗： 把原始圖案分成 3 幅不同顏色的灰階圖案， 分別蝕刻； 在每步蝕刻和吸附一種
熒光分子之后， 加入 PLL-g-PEG 溶液孵育， 再加一層防污涂層（ antifouling layer） ， 阻
礙空白區(qū)域上的進一步吸附， 然后進入下一步的蝕刻和吸附另一種熒光分子。

（ 四） 總結

PRIMO 強大的生物建模能力和對細胞微環(huán)境的控制， 可以為多種生物學實驗帶來全新
的、 突破性視角， 可用于研究細胞遷移、 細胞黏附、 細胞趨觸性、 2D/3D 細胞標準化培養(yǎng)、
細胞球培養(yǎng)、 生物力學、 組織工程、 微流體等多個領域。

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參考文獻：
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【2】 Polio, S. R., et. al., Extracellular matrix stiffness regulates force
transmission pathways in multicellular ensembles of human airway smooth muscle cells,
bioRxiv preprint first posted online Aug.29, 2018, doi:
http://dx.doi.org/10.1101/402842.
【3】Uroz, M., et. al., Traction forces at the cytokinetic ring regulate cell division
and polyploidy in the migrating zebrafish epicardium, Nature Materials, 2019，
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【4】 Mohammed, D., et. al., Substrate area confinement is a key determinant of cell
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https://doi.org/10.1038/s41567-019-0543-3.
【5】 Luo, X., et. al., Different integrins mediate haptotaxis of T lymphocytes
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Jan.2, 2019, doi: http://dx.doi.org/10.1101/509240.
【6】 Alveole PRIMO PPT.
【7】 Celine Stoecklin et. al.,A New Approach to Design Artificial 3D Microniches
with Combined Chemical, Topographical, and Rheological Cues, Advanced
Biosytems,2018 (group of Virgil Viasnoff, MBI, Singapore)
【8】Pierre-Olivier Strale et. al., Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular
Adsorption, Advanced Materials, 28, 2016, pp.2024-2029.