PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是一項(xiàng)革命性的發(fā)明，通過PCR過程，我們可以很容易地將靶模板分子數(shù)量復(fù)制并指數(shù)放大，用于后續(xù)的研究及操作，是生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)分子診斷、檢驗(yàn)檢疫的核心工具之一。

第一代PCR通過凝膠電泳（如圖一所示）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)分析以獲得樣本核酸的定性結(jié)果，只能粗略檢測核酸分子大小和含量。這種方法有三個最突出的缺點(diǎn)：開放式操作帶來潛在的污染風(fēng)險、報告信號檢測靈敏度不足和不能準(zhǔn)確定量。

圖一：凝膠電泳核酸定性分析

（改自：https:// bio1151.nicerweb.com）

對這三個缺點(diǎn)的解決，催生了第二代PCR技術(shù)qPCR（實(shí)時熒光定量PCR）技術(shù)。如圖二所示，在qPCR中，使用熒光染料或探針在封閉體系中監(jiān)測每個循環(huán)后的擴(kuò)增狀況，具體的定量信息通過擴(kuò)增信號閾值Ct獲得。在得到Ct值后，待檢測靶標(biāo)的濃度可借助于外部校準(zhǔn)器（如標(biāo)準(zhǔn)曲線）或內(nèi)源性對照估算得到相對定量結(jié)果。當(dāng)前，qPCR技術(shù)已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用。

圖二：qPCR核酸間接定量過程

（改自：https://www.unbc.ca/genetics/training/gene-expression）

qPCR技術(shù)本身仍然存在一些不足：由于同一反應(yīng)體系內(nèi)不同靶模板分子共擴(kuò)增導(dǎo)致的競爭性抑制，起始靶模板分子數(shù)量太少使擴(kuò)增信號被體系本底湮沒而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線定量導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線的變動會造成定量結(jié)果的差異，抑制劑導(dǎo)致靶模板擴(kuò)增效率降低從而影響定量準(zhǔn)確性。另外，因?yàn)橐粋�Ct值的差異會導(dǎo)致定量結(jié)果一倍的差別，所以實(shí)驗(yàn)操作誤差的存在導(dǎo)致難以準(zhǔn)確區(qū)分兩倍以內(nèi)差異的目的靶模板分子，如單倍體與二倍體，二倍體與三倍體。這些都是qPCR固有的缺陷，很難通過優(yōu)化來解決。

研究者認(rèn)識到反應(yīng)體系分隔、終點(diǎn)PCR檢測以及泊松統(tǒng)計的組合可以用來克服qPCR的上述不足，這種方法后來被稱為數(shù)字PCR（dPCR），即第三代PCR技術(shù)。在數(shù)字PCR中，靶模板DNA分子被分布到多個獨(dú)立微反應(yīng)體系中，當(dāng)微反應(yīng)體系的數(shù)量足夠多時，絕大多數(shù)微反應(yīng)體系中最多只有一個靶模板分子。在PCR擴(kuò)增一定循環(huán)數(shù)后，含有靶模板分子的微體系產(chǎn)生陽性信號，而沒有靶模板分子的微體系產(chǎn)生陰性信號，通過對陰陽性信號計數(shù)并利用泊松分布校準(zhǔn)就可得到靶DNA分子的絕對定量結(jié)果。近年來，皮升納升級的微液滴技術(shù)為數(shù)字PCR提供了一種實(shí)用且低成本化的實(shí)施方案，即微液滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）。

與qPCR技術(shù)不同，dPCR可在不借助任何外部或內(nèi)源參照的情況下直接對未知樣本靶標(biāo)進(jìn)行檢測并定量。如圖三所示，ddPCR技術(shù)的整體操作流程可簡單地歸述為：首先將含有核酸分子的反應(yīng)體系分散成成千上萬個納升級的液滴；完成液滴PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程；利用流式熒光檢測或熒光成像檢測技術(shù)將液滴判別為陽性（包含靶模板分子）、陰性（不包含靶模板分子）液滴，經(jīng)過熒光信號峰值提取、統(tǒng)計計數(shù)和泊松分布校正直接得到未知樣本中靶模板分子的濃度。通過上述流程，ddPCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對未知樣本中靶標(biāo)的檢測和絕對定量。

圖三：ddPCR核酸直接定量過程

在qPCR中，樣本靶模板分子的擴(kuò)增過程處于大體積反應(yīng)系統(tǒng)中，靶模板分子的共擴(kuò)增導(dǎo)致的競爭性抑制降低了模板分子的擴(kuò)增效率，ddPCR通過將靶模板分子相互分隔在獨(dú)立的微體系中完美地解決了該問題，數(shù)量充足的微體系的相互間隔使得每個靶模板分子能夠單獨(dú)地在一個腔室中完成擴(kuò)增反應(yīng)，且每個腔室中的引物、探針以及反應(yīng)底物也都與其他腔室相互隔離，降低了非特異性擴(kuò)增的可能。

在qPCR中，存在一些特定場合例如樣本量稀少導(dǎo)致的起始靶模板分子數(shù)量少的情況。在這些樣本稀缺場合中，靶模板分子擴(kuò)增信號易被體系本底湮沒而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。而在ddPCR中，將靶模板分子分隔到相互獨(dú)立的微體系中這一過程相當(dāng)于變相實(shí)現(xiàn)了對靶模板分子的富集，結(jié)合對微體系反應(yīng)信號獨(dú)立檢測的技術(shù)手段使得對單個靶模板分子的檢測成為現(xiàn)實(shí)，從而使ddPCR達(dá)到單分子的檢測靈敏度。

在qPCR中，待檢樣本的起始模板量需要借助梯度稀釋的已知樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量，因此是一種需要借助標(biāo)準(zhǔn)曲線的間接、相對核酸定量方法。這種定量方法有兩個主要問題：首先，用來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知樣本的量往往通過測OD值或熒光染料定量來得到，定量結(jié)果不夠準(zhǔn)確，而且得到的量并不能反應(yīng)可擴(kuò)增的模板量。其次，實(shí)驗(yàn)操作誤差和系統(tǒng)誤差也會造成標(biāo)準(zhǔn)曲線的偏移，從而導(dǎo)致未知樣本的定量出現(xiàn)偏差。而在ddPCR中，在得到陰陽性液滴的判定結(jié)果并統(tǒng)計計數(shù)后，根據(jù)靶模板分子分散進(jìn)入微體系符合泊松分布規(guī)律的原理對統(tǒng)計計數(shù)結(jié)果進(jìn)行泊松分布校準(zhǔn)就可直接得到待檢樣本起始模板量（M）的定量結(jié)果：

其中，N是總液滴數(shù)，M'是統(tǒng)計計數(shù)獲得的“陽性”液滴數(shù)。ddPCR直接簡潔的定量過程使得其起始模板量定量結(jié)果更精確。

在qPCR中，樣本中一些復(fù)雜基質(zhì)特別是PCR抑制劑的存在，會降低靶模板擴(kuò)增效率，從而影響系統(tǒng)拷貝數(shù)檢測靈敏度。而對于ddPCR來說，體系分隔過程將反應(yīng)體系平均分配到幾萬個反應(yīng)腔室中，這顯著降低了每個微體系中PCR抑制劑的量，使得ddPCR的反應(yīng)效率大大優(yōu)于qPCR，釋放了靶模板分子自身特異性擴(kuò)增的效率。

此外，在qPCR中，一個Ct值的差異會導(dǎo)致一倍的定量結(jié)果差別，所以qPCR在區(qū)分兩倍以內(nèi)差異的靶模板分子，如單倍體與二倍體、二倍體與三倍體等特殊場合難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分，而ddPCR直接絕對定量、單分子檢測靈敏度、對于微小變化的敏感檢測的特性使得其在應(yīng)用于上述特殊場合中游刃有余。

數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展使得PCR定量完成了由間接定量到直接定量，由相對定量到絕對定量轉(zhuǎn)變。數(shù)字PCR的絕對定量能力，使同一檢測在不同時間、不同批次、以及不同實(shí)驗(yàn)室間定量結(jié)果的比對與校正更加準(zhǔn)確。而數(shù)字PCR單分子水平的檢測能力，也使它能夠勝任微量核酸分子的檢測。

結(jié)    語

技術(shù)革新的過程總是相似，日益提高的技術(shù)需求和日益復(fù)雜的應(yīng)用場合催生著一代又一代新技術(shù)誕生。在精準(zhǔn)醫(yī)療時代浪潮中，作為引領(lǐng)PCR技術(shù)格局的數(shù)字PCR技術(shù)，將為腫瘤液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、重癥感染早期診斷、器官移植檢測等重大醫(yī)學(xué)問題提供強(qiáng)勁有力的驅(qū)動引擎。

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