NACIA數(shù)字PCR用引物與普通PCR引物設(shè)計要求不同：普通PCR的目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格；而數(shù)字PCR引物跟real-time PCR引物一樣對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。
NACIA數(shù)字PCR引物及探針設(shè)計的總體原則
v 先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針。
v 所選列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有最小二級結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增片段。
v 擴(kuò)增長度應(yīng)不超過400bp，理想的最好能在50-150bp內(nèi)。
v 保持GC含量在30%~80%之間。
v 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）。
v 將引物和探針互相進(jìn)行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。
v 一些需額外考慮的因素：
☆ 引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基 。
☆ 如果不能避免二級結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
☆ 盡量避免Dimer（二聚體）配對區(qū)域在3’末端。
☆ 盡量避免3’末端連續(xù)幾個堿基錯配形成False priming（錯配）
☆ 衡量二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng)，如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)
盡量保證自由能的絕對值<10（可選）
為了避免基因表達(dá)過程中檢測到DNA，設(shè)計應(yīng)盡量跨內(nèi)含子區(qū)，這可確保擴(kuò)增的產(chǎn)品只能使用mRNA作為模板。 NACIA數(shù)字PCR引物設(shè)計基本原則
☆ 擴(kuò)增片段長度：50-150個堿基
☆ 引物長度：18-24個堿基（20個堿基最優(yōu)）
☆ Tm值：58℃到 60℃，引物之間的TM相差避免超過2℃
☆ GC含量：30%到80%
☆ 3’端的最后5個堿基內(nèi)不應(yīng)有超過2個G+C
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是不能有4個連續(xù)的G
☆ 探針位置盡可能地靠近上游引物，但不能重疊
NACIA數(shù)字PCR探針設(shè)計基本原則
☆ 探針長度：13-25個堿基（MGB探針）；13-30個堿基（普通Taqman探針）
☆ Tm值：68 °C 到 70 °C(PrimerExpress 計算結(jié)果)；通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃）
☆ GC含量：30%到80%
☆ 5’端第一個堿基不能為G
☆ 盡量避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是不能有4個連續(xù)的G ；避免6個連續(xù)的A出現(xiàn)
☆ 對于MGB探針，盡量避免在探針的中部出現(xiàn)2個或2個以上連續(xù)的C,3'端的堿基應(yīng)避免為“GGG”或“GGAG”
☆ 對于FAM 標(biāo)記的探針，5’端的第二個堿基不能為G
☆ 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量
NACIA數(shù)字PCR探針熒光標(biāo)記物選擇: NACIA數(shù)字PCR多重探針設(shè)計原則
☆ 所有靶基因的引物或探針的Tm 值要相接近，引物的Tm 值建議在55-60℃，探針的Tm 值高于引物Tm 值5-10℃。
☆ 不同靶基因的探針標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，比如FAM、HEX或CY5，并且要選擇發(fā)射波長之間滲透最小的熒光報告基團(tuán)，
☆ 同時要與數(shù)字PCR 系統(tǒng)的熒光檢測通道參數(shù)兼容。 NACIA數(shù)字PCR推薦引物探針設(shè)計軟件:Beacon designer, Primer 3 ,Primer express等。