華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科和加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校醫(yī)學(xué)院兒科的研究人員建立了一個(gè)穩(wěn)定可靠的基于RNA磁珠提取和數(shù)字PCR的方法，可從糞便樣本中檢測(cè)與EE（熱帶腸�。╆P(guān)聯(lián)的人mRNA，靈敏度可達(dá)20拷貝GAPDH mRNA/200mg糞便樣本。
已有報(bào)道表明病人糞便中存在人mRNA，可作為反應(yīng)病人消化道病理狀態(tài)的潛在標(biāo)記物。然而以糞便為樣本檢測(cè)RNA必須克服兩大挑戰(zhàn)：一是糞便中含有大量PCR抑制劑，會(huì)嚴(yán)重影響PCR效率甚至PCR失��；二是糞便樣本中的RNA絕大部分是微生物來(lái)源的，人mRNA含量極少。所以這項(xiàng)應(yīng)用需要超靈敏的核酸分離檢測(cè)技術(shù)。
文中使用了數(shù)字PCR對(duì)大量?jī)龃婕S便樣本中多達(dá)70多個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，其中以GAPDH為內(nèi)參，探針以VIC標(biāo)記，各目的基因以FAM標(biāo)記。所有70個(gè)樣本都已經(jīng)雙塘吸收測(cè)試法檢測(cè)，同時(shí)隨機(jī)抽取樣本用數(shù)字PCR和RT-qPCR進(jìn)行檢測(cè)，比較結(jié)果顯示，數(shù)字PCR相對(duì)于qPCR具有更高的靈敏度�；�于數(shù)字PCR的糞便樣本RNA檢測(cè)手段可用篩選與消化道疾病相關(guān)的核酸標(biāo)記。
大家知道定量PCR是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的分析處理進(jìn)而獲得所謂Cq值，再根據(jù)Cq來(lái)對(duì)樣品定量。Cq值容易受PCR效率，特別是PCR抑制劑影響，所以qPCR在檢測(cè)靶標(biāo)核酸豐度低及抑制成分高的樣本時(shí)，靈敏度和準(zhǔn)確度會(huì)大打折扣。而數(shù)字PCR通過(guò)PCR終點(diǎn)判斷微滴陰陽(yáng)性進(jìn)而定量樣本的方式，受PCR效率和抑制物影響非常小，特別適合諸如：
1、以糞便、血液為樣本的病原微生物檢測(cè)、腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)；
2、以土壤、污水、淤泥、酒泥等為樣本的環(huán)境生物學(xué)研究和病原微生物監(jiān)測(cè)；
3、經(jīng)復(fù)雜工藝制作的含大量抑制物的食品材料中轉(zhuǎn)基因成分、動(dòng)植物成分鑒定和含量分析，及致病微生物的檢測(cè)（CIQ/CDC）；
4、以骸骨、毛發(fā)、分泌物及排泄物，或者口腔脫離細(xì)胞、動(dòng)物鱗片及皮膚，陳舊標(biāo)本為樣本的法醫(yī)學(xué)、動(dòng)物遺傳多樣性管理及野生動(dòng)物保護(hù)等涉及核酸檢測(cè)分析的應(yīng)用。
【Agapova S, Stephenson K, Manary M, Weisz A, Tarr PI, Mkakosya R, Maleta K, Shulman RJ, Manary M, Shaikn N. Detection of Low Concentration Host mRNA Transcripts in Malawian Children at Risk for Environmental Enteropathy. J Pediatr Gastroenterol Nutr.2012.】
近年來(lái)在小RNA的研究方面長(zhǎng)非編碼RNA（long noncoding RNA，IncRNA）的研究成為熱點(diǎn)，IncRNA是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子的總稱。IncRNA的表達(dá)水平相對(duì)于編碼蛋白的基因一般比較低，重要的是很多這些IncRNA雖然不直接參與基因編碼和蛋白質(zhì)合成，但是在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、剪切和修飾具有十分重要的功能，在很多生命活動(dòng)中均起著舉足輕重的作用，和疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療有著密切的關(guān)系，迅速成為當(dāng)今分子生物學(xué)最熱門(mén)的前沿研究領(lǐng)域之一。另外，IncRNA的亞細(xì)胞位置上也呈多樣化，在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器均有分布，甚至某些IncRNA具有獨(dú)特的亞細(xì)胞位置，有可能是全新的亞細(xì)胞構(gòu)成。
雖然研究甚少，但是人們逐漸認(rèn)識(shí)到IncRNA具有重要的功能，因此，IncRNA的異常和疾病關(guān)系密切，將成為理解疾病、尋找疾病分子標(biāo)記物、藥物靶點(diǎn)的新的研究方向。
最近美國(guó)科學(xué)家在NUCLEC ACID THERAPEUTICS 上發(fā)表了首篇將數(shù)字PCR應(yīng)用于IncRNA研究的文獻(xiàn)。文章通過(guò)絕對(duì)定量的方式，對(duì)IncRNA分子進(jìn)行直接定量，從而大致判斷其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控屬于順式還是反式作用；同時(shí)也對(duì)不同IncRNA以及管家基因在亞細(xì)胞水平上的表達(dá)做了分析。
【David W, Dodd, Keith T. Gagnon, and David R. Corey. Digital Quantitation of Potential Therapeutic Target RNAs. NUCLEIC ACID THERAPEUTICS, Volume 23,Number 2,2013.】
來(lái)自Fred Hutchinson癌癥研究中心等處的研究員在《Nature Method》發(fā)表文章證明了數(shù)字PCR技術(shù)能用于不同情況下，準(zhǔn)確，可重復(fù)性的血漿和血清microRNA（miRNA）量化檢測(cè)，這將為miRNA及其它核酸用于循環(huán)生物標(biāo)志物的檢測(cè)鋪墊了道路。
文章的第一作者，F(xiàn)red Hutchinson癌癥研究中心人類(lèi)生物學(xué)部Muneesh Tewari博士表示，“在循環(huán)系統(tǒng)miRNA診斷領(lǐng)域，數(shù)字PCR能幫助我們進(jìn)行生物標(biāo)記物研究，直接比較同一實(shí)驗(yàn)室跨天多次實(shí)驗(yàn)，甚至不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果”
實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）已被廣泛用于血液樣品miRNA的分析測(cè)試中。但是研究人員發(fā)現(xiàn)，血清或血漿中的miRNA qPCR測(cè)量出現(xiàn)了極高的差異性，無(wú)法用作穩(wěn)定的血液生物標(biāo)志物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，因此這一領(lǐng)域的研究人員一直在尋求一種能獲得更可靠結(jié)果的新方法。
數(shù)字PCR具有許多優(yōu)于定量PCR的優(yōu)點(diǎn)，比如無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及不受不同樣品和試驗(yàn)過(guò)程中PCR擴(kuò)增效率變化的影響，就能獲得絕對(duì)定量。
為了評(píng)估每個(gè)工作流程的步驟，包括連續(xù)稀釋準(zhǔn)備，反轉(zhuǎn)錄（RT）和PCR擴(kuò)增，Tewari博士和他的團(tuán)隊(duì)分別在三個(gè)獨(dú)立的工作日中，通過(guò)數(shù)字PCR嵌套分析對(duì)比定量PCR，對(duì)水和血漿中6中不同的合成miRNA各稀釋系列的cDNA進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比較于qPCR，數(shù)字PCR在PCR特異性變化方面，具有更高的精確度（48-72%的更少變異系數(shù)）。
接下來(lái)，研究小組進(jìn)行血清miRNA的qPCR和數(shù)字PCR并列比較檢測(cè)。他們收集了20例晚期前列腺癌患者，和20例年齡相匹配的男性對(duì)照血清樣品，分析其中的miR-141豐度，miR-141是一種已被證明的晚期前列腺癌的生物標(biāo)志物。研究人員分別在不同的三天里準(zhǔn)備了qPCR和數(shù)字PCR分析的不同稀釋濃度，并進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR相比于qPCR，能提高7倍不同一天里實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)率，這在對(duì)照研究中也得到了證實(shí)：數(shù)字PCR的結(jié)果更為可信（p=0.0036 vs. p=0.1199）。
【Christopher M Hindson, John R Chevillet, Hilary A Briggs, Emily N Gallichotte, Ingrid K Ruf, Benjamin J Hindson, Robert L Vessella & Muneesh Tewari Absolut Quantification by droplet digital PCR versus Analog real-time PCR. Nature Methods | ADVANCE ONLINE PUBLICATION doi:10.1038/nmeth.2633.】
近期來(lái)自美國(guó)紐約西奈山醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家接連刊發(fā)了數(shù)字PCR應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞基因表達(dá)研究的最新研究成果。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESCs）簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞。ES細(xì)胞具有細(xì)胞全能性，在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細(xì)胞具有發(fā)育成完整動(dòng)物體的能力，可以為細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞分化研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料。
研究人員發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-137（miR-137）在ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用�？茖W(xué)家使用數(shù)字PCR和qPCR同時(shí)驗(yàn)證了在不同細(xì)胞周期條件下miR-137的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-137在細(xì)胞M期（metaphase）表達(dá)顯著上調(diào)。聯(lián)合其他實(shí)驗(yàn)證據(jù)可以表明，miR-137可以通過(guò)抑制下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)ES細(xì)胞的增殖和分化。
【Ke Jiang, Chunyan Ren, Venugopalan D. Nair MicroRNA-137 Represses Klf4 and Tbx3 During Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Research (2013) 11,1299-1313.】