發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物的研究目前正面臨著重要的挑戰(zhàn)，因?yàn)樵谂R床前研究顯示有效果的化合物只有5％的能繼續(xù)被開(kāi)發(fā)，成為獲得許可的藥物。傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)模型在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的早期階段被用于評(píng)估候選藥物，然而，有越來(lái)越多的證據(jù)表明，在二維單層生長(zhǎng)的細(xì)胞并不能準(zhǔn)確地反映腫瘤的生物學(xué)復(fù)雜性。

 

    對(duì)兼容高通量篩選的更好的體外模型的需求引導(dǎo)了3D細(xì)胞培養(yǎng)模型的發(fā)展，尤其是多細(xì)胞微球，其將保留腫瘤的許多形態(tài)學(xué)和遺傳性狀。在體外實(shí)驗(yàn)中，3D培養(yǎng)模型被廣泛地認(rèn)為相比2D形式的培養(yǎng)系統(tǒng)是更加具有生理相關(guān)性的模型。3D模型更加準(zhǔn)確地反映了體內(nèi)微環(huán)境中的復(fù)雜性，并被用于許多的研究領(lǐng)域，比如腫瘤學(xué)[1]，肝臟毒性[2]，神經(jīng)生物學(xué)[3]，胰腺研究[4]，腎臟學(xué)[5]，以及干細(xì)胞研究[6]。這些研究顛覆了我們對(duì)體外培養(yǎng)中以及體內(nèi)的細(xì)胞行為學(xué)的認(rèn)識(shí)。然而，由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的限制，以3D培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行高通量篩選卻發(fā)展地非常緩慢。技術(shù)瓶頸包括實(shí)驗(yàn)的異質(zhì)性、低通量、難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及昂貴的成本。

 

        在這里，我們描述通過(guò)兩種方法進(jìn)行3D培養(yǎng)的細(xì)胞球體檢測(cè)：1）在超低附著板中；2）在半固體瓊脂上。這兩種方法都可在96和384孔微孔板形式上進(jìn)行。

 

    我們隨后用Acumen hci激光掃描技術(shù)進(jìn)行快速的整板圖像采集（5分鐘/塊），給出一系列參數(shù)，例如球體的數(shù)量、面積和體積。Acumen hci是適于對(duì)微球體進(jìn)行高內(nèi)涵分析的完美系統(tǒng)，它獨(dú)有的全孔掃描能力可一次采集單孔中不同位置所有微球體的信息，而具有一定景深的掃描鏡使得可對(duì)孔中處于各層的球體也一次捕獲，對(duì)單個(gè)球體體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)而無(wú)需對(duì)其進(jìn)行Z層斷層掃描，多次采集數(shù)據(jù)。

 

 

A：   在超低粘附板中形成腫瘤微球體

Corining的超低粘附板，采用不透明的壁和清晰、圓形的孔底。專有的超低細(xì)胞粘附涂層，具有親水性、生物惰性的和不可降解的特性，通過(guò)共價(jià)連接到孔底部的內(nèi)表面上。這種對(duì)培養(yǎng)孔底部獨(dú)特的設(shè)計(jì)，使3D細(xì)胞球體培養(yǎng)物可高度可重復(fù)地生長(zhǎng)。不透明的側(cè)壁和專有板底網(wǎng)格形式的設(shè)計(jì)大大降低了熒光、冷光背景和孔與孔之間的串?dāng)_。在孔中，球狀體可以生成，培養(yǎng)，并進(jìn)行熒光或者冷光信號(hào)的檢測(cè)，而無(wú)需將球狀體轉(zhuǎn)移。目前，Corning超低粘附板具有96孔和384孔板形式，這兩種板型都很方便進(jìn)行自動(dòng)化。   a) 將懸浮于完全培養(yǎng)基中的肝癌細(xì)胞株HepG2的單細(xì)胞鋪板于Corning超低粘附板中（#4520&3830），鋪板密度為96孔板每孔200μl含有300個(gè)細(xì)胞，384孔板中每孔50μl含有300個(gè)細(xì)胞 b) 在24小時(shí)內(nèi)，懸浮的細(xì)胞將組裝成單個(gè)3D微球，沉淀在細(xì)胞中央，如右圖Figure1A所示 c) 72小時(shí)后，將50%的培養(yǎng)基更換成含有2倍濃度的Doxorubicin（阿霉素）的新鮮培養(yǎng)基，更換后終濃度為316pM~3.16μM d) 形成的微球體繼續(xù)培養(yǎng)6天

Figure 1A

 

	96孔板	384孔板	Figure 1B
基底層（含0.6%瓊脂的培養(yǎng)基）	25μl	10μl
細(xì)胞層（含0.4%瓊脂的單細(xì)胞懸液）	50μl含有500個(gè)細(xì)胞	20μl含有150個(gè)細(xì)胞
培養(yǎng)基覆蓋層	75μl	30μl
a) 按照以上體系進(jìn)行軟瓊脂的配制 b) 將含有單細(xì)胞的軟瓊脂培養(yǎng)于37度培養(yǎng)箱 c) 24小時(shí)后，將5μl的Doxorubicin（阿霉素）加入孔中，終濃度為1nM~1μM d) 繼續(xù)培養(yǎng)微球體4天，3天更換一次含有阿霉素的覆蓋層培養(yǎng)基

 

C：染色和圖像采集

a) 在含有細(xì)胞微球的孔中加入染料Calcein-AM（終濃度為5μM）對(duì)兩種方法形成的腫瘤微球體進(jìn)行染色，染料加入后在37度孵育1小時(shí) b) 板子隨后用Acumen進(jìn)行圖像采集（每板的圖像采集和數(shù)據(jù)輸出需要5分鐘） c) 數(shù)據(jù)是在線分析的，在掃描圖像的同時(shí)即獲得了，得出的報(bào)告含有球體的數(shù)量、面積和體積、熒光強(qiáng)度等等信息

Figure 1C

                                          

A          96孔板
	Figure 2A: 生長(zhǎng)在96孔超低粘附板中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像底部顯示了加入每孔的阿霉素濃度。2B-C：藥物量效曲線（mean±SEM，n=6）
B	C

 

A          384孔板
	Figure 3A:生長(zhǎng)在384孔超低粘附板中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像底部顯示了加入每孔的阿霉素濃度。3B-C：藥物量效曲線（mean±SEM，n=8）
B	C

 

 

A	B	C
	D
		Figure 4A: 生長(zhǎng)在96孔板軟瓊脂中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像上顯示了加入每孔的阿霉素濃度。4B-D：藥物量效曲線（mean±SEM，n=3）

 

A	B	C
	D
		Figure 5A: 生長(zhǎng)在384孔板軟瓊脂中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像上顯示了加入每孔的阿霉素濃度。5B-D：藥物量效曲線（mean±SEM，n=4）

 

 

        生長(zhǎng)在 3D培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞群體、不同細(xì)胞類型、微組織結(jié)構(gòu)相互協(xié)調(diào)、相互作用，模擬了生命物質(zhì)在體內(nèi)微環(huán)境中的真實(shí)生存環(huán)境，為研究者對(duì)疾病的剖析和攻克提供了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)信息。我們?cè)?6和384微孔板中建立了兩種簡(jiǎn)單且穩(wěn)定的進(jìn)行腫瘤微球體3D培養(yǎng)的方法，通過(guò)染色和圖像采集，獲得數(shù)目、面積、體積和熒光強(qiáng)度等信息。藥物量效曲線的一致性結(jié)果體現(xiàn)了兩種方法的可靠性和可重復(fù)性，這些數(shù)據(jù)表明acumen hci激光掃描系統(tǒng)是對(duì)基于兩種培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的腫瘤微球體進(jìn)行高通量（5分鐘/板）分析的理想平臺(tái)，該平臺(tái)在過(guò)去的研究中已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于腫瘤學(xué)[7-9]和干細(xì)胞研究領(lǐng)域[10-12]。

 

 

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